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文檔簡介
1、目的:
利用SELEX技術篩選、鑒定出慢性粒細胞白血病K562細胞的寡核苷酸適配子,測定出ssDNA文庫與K562細胞的結合率,并對克隆適配子進行一級結構同源性分析和二級結構預測,為白血病的基因診斷和靶向基因治療奠定實驗基礎。
方法:
體外合成長度為88個堿基的隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫,采用生物素-鏈霉親和素磁珠法制備次級文庫,以正常人血液中提取的中性粒細胞為反篩細胞,利用SELEX技術
2、篩選出與慢性粒細胞白血病K562細胞特異結合的適配子。將篩選得到的適配子回收純化后連接pGEM-T質粒載體,經(jīng)藍白篩選后,隨機挑選24個克隆子進行序列測定。采用熒光標記引物法檢測ssDNA文庫與K562細胞的親和力,并用DNAMAN軟件對適配子序列進行一級結構同源性分析和二級結構預測。
結果:
SELEX篩選產(chǎn)物PCR擴增時最佳退火溫度為45℃;每輪篩選的模板含量和循環(huán)次數(shù)都各不相同;瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,
3、電泳條帶隨SELEX輪數(shù)的增加逐漸變細變致密。經(jīng)過13輪篩選,慢性粒細胞白血病K562細胞適配子的結合率不斷增高,適配子的吸光度A值從0.12上升到1.25,至第13輪A值無明顯增高。測序結果顯示,絕大部分適配子與預期片段長度相同,但有幾個適配子短于預期片段長度。一級結構分析發(fā)現(xiàn)無同源序列,但可分為6個家族(family),其中5個家族各自具有保守序列,家族6無保守序列。二級結構分析表明:適配子形成的莖環(huán)、凸環(huán)結構可能是與K562細胞特
4、異性結合的結構基礎。24個克隆適配子中,第10號適配子與慢性粒細胞白血病K562細胞的結合率最高,為45.2%,而與正常人血液中提取的中性粒細胞的結合率僅為2.8%。
結論:
1、利用SELEX技術從體外構建的88 nt的ssDNA文庫中成功篩選出高親和力、高特異性的慢性粒細胞白血病K562細胞適配子;
2、成功測出ssDNA文庫與慢性粒細胞白血病K562細胞的結合率;
3、成功將
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