異牛肝菌素對人慢性髓系白血病K562細胞增殖抑制的分子機制研究.pdf

1、目的：隨著社會的發(fā)展，人們逐漸意識到化學合成類藥品給人類自身健康及生活環(huán)境帶來的負面影響，回歸自然、保護環(huán)境已成為一種處理人類和環(huán)境關系的潮流思想。天然藥物以其在治療上的獨特優(yōu)勢（來自大自然，毒副作用小及治病范圍廣）而倍受重視。然而大多數(shù)天然藥物的成分不明，炮制方法單一。其有效成分的分離純化技術低下，治病機制大多不為人知，因此限制了其應用范圍。為了更好的利用天然藥物，對其有效成分進行分離純化并研究其作用機制迫在眉睫。
　　近年來，

2、大量研究發(fā)現(xiàn)真菌和植物的次生代謝產(chǎn)物在抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等方面有顯著的作用。2014年本課題組從一種食藥兼用的大型真菌—黃乳粘蓋牛肝菌的石油醚相中純化出一種代謝產(chǎn)物，化學名稱為：3,6-二羥基-2-(2Z,6E,10E)-3,7,11,15-六甲基十六碳-2,6,10,14-四烯苯乙酯，和之前研究發(fā)現(xiàn)的牛肝菌素是同分異構(gòu)體，命名為異牛肝菌素（iso-suillin），經(jīng)過幾年的研究發(fā)現(xiàn)，iso-suillin表現(xiàn)出較強的生物活性，

3、能夠有效抑制SMMC-7721、BGC、K562、A549等腫瘤細胞系的生長，而且與順鉑（CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）比較，iso-suillin表現(xiàn)出了更強的抑瘤作用，并且對正常人的淋巴細胞沒有明顯毒性。
　　白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病。克隆性白血病細胞因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能。我國各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中

4、占第六位，嚴重威脅人類健康。雖然多種療法對白血病的治療有一定療效，但白血病仍然是一種死亡率很高的疾病，尋找治療白血病的藥物仍然是目前研究者的迫切任務。本課題組對人白血病K562細胞系研究發(fā)現(xiàn)，iso-suillin對K562細胞的抑制作用可以通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導細胞凋亡實現(xiàn)，但其對K562細胞增殖抑制作用的分子機制沒有深入了解，本研究在之前研究的基礎上繼續(xù)對iso-suillin抑制K562細胞增殖的分子機制進行深入探索。通

5、過揭示iso-suillin誘導K562細胞增殖抑制的分子機制，尋找對白血病細胞殺傷的關鍵靶點，為白血病的治療提供理論基礎及可能的藥物。
　　方法：
　　1.K562細胞培養(yǎng)
　　K562細胞以DMEM培養(yǎng)基，含10％FBS、1%青鏈霉素混合液(100×)，置于37℃5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.基因芯片技術檢測iso-suillin對K562細胞全基因體轉(zhuǎn)錄譜的影響及生物信息學分析
　　常規(guī)

6、培養(yǎng)K562細胞，用終濃度為5.48μM的iso-suillin作用24 h，提取總RNA后進行RNA品質(zhì)檢測，RNA信號放大與熒光標定后，Phalanx OneArrayTM雜交，影像掃描與數(shù)據(jù)擷取，對芯片數(shù)據(jù)進行篩選和校正，計算對照組（C）和加藥組（T）熒光訊號的比值，根據(jù)log2（ratio）和p-value篩選差異表達基因，差異基因的篩選條件設定為log2|ratio|≥1且p-value<0.05；篩選出對照組和iso-sui

7、llin處理組差異表達基因后，差異基因分別進行GO term功能富集分析（包括所處的細胞組分CC、分子功能MF和參與的生物過程BP）和KEGG信號通路富集分析。根據(jù)挑選出的差異基因，計算這些差異基因同GO分類中某或幾個特定的分支的超幾何分布關系，GO分析會對每個有差異基因存在的GO返回一個P值，小的P值表示差異基因在該GO中出現(xiàn)了富集；根據(jù)挑選出的差異基因，計算這些差異基因同KEGG pathway的超幾何分布關系，pathway分析會

8、對每個有差異基因存在的pathway返回一個P值，小的P值表示差異基因在該pathway中出現(xiàn)了富集。P值越小，-lin（P-value）越大，富集顯著性越明顯。用-lin（P-value）作餅形圖。
　　3.MTT法檢測iso-suillin對K562細胞抑制率
　　不同濃度iso-suillin處理K562細胞后，加入5 mg/ml MTT2-4 h，用DMSO溶解結(jié)晶，酶標儀測吸光值，計算抑制率并繪制細胞增殖抑制曲線。

9、
　　4.軟瓊脂克隆形成試驗檢測iso-suillin對K562細胞克隆形成的影響
　　把處于對數(shù)生長期的K562細胞以1×105/ml濃度種于6孔板，用不同終濃度iso-suillin處理K562細胞，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，以每瓶800個細胞種于12.5 cm2小培養(yǎng)瓶中，待有明顯肉眼可見的克隆形成時倒掉培養(yǎng)基，每瓶加入1 ml軟瓊脂，置冰上冷卻凝固，用結(jié)晶紫染色5 min，用預冷PBS緩沖液洗2次，拍照

10、，克隆形成計數(shù)并測量克隆直徑。
　　5.流式細胞術檢測iso-suillin對K562細胞周期分布的影響
　　把處于對數(shù)生長期的K562細胞以1×105/ml濃度種于6孔板，加入不同濃度iso-suillin，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞。離心棄上清，用預冷PBS緩沖液洗2次，用70%乙醇固定過夜（先用300μlPBS重懸細胞，再緩慢滴加700μl無水乙醇，混勻），離心收集細胞，預冷PBS洗2次，每個細

11、胞樣品加入500μl PI染色工作液（50 ug/ml，含RNA酶），37℃避光孵育30 min，流式細胞儀上機檢測，flowjo7.6.5軟件分析各時期細胞分布，計算處于G0/G1、S、G2/M期細胞數(shù)目，作直方圖。
　　6.Western blot檢測iso-suillin對K562細胞增殖相關蛋白表達的影響
　　K562總蛋白提取后，用12%分離膠和4%濃縮膠電泳，0.22μM PVDF膜200 mA恒流濕轉(zhuǎn)1-2 h

12、，5%脫脂奶粉封閉2.5 h，4℃孵育一抗過夜，洗膜3次，孵育二抗37℃1 h，洗膜3次，掃膜，測量條帶灰度值。
　　7.K562細胞p53基因突變驗證
　　常規(guī)方法提取K562總DNA，用引物F-P53 CATCGCTATCTGAGCAG CGCTCA和R-P53 TCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGAC進行PCR擴增，樣品用1%瓊脂糖凝膠100 V20 min電泳，紫外線下找到對應條帶，切膠回收，得到p53基因片

13、段，送武漢擎科測序部做雙向測序，在NCBI網(wǎng)站查取p53mRNA CDS序列，用DNAMAN軟件進行序列比對。
　　8.P38抑制劑對iso-suillin抑制K562細胞增殖相關因素的影響
　　培養(yǎng)的K562細胞中加入p38抑制劑（SB203580）0.5μM（IC50）預處理30 min后，再用iso-suillin處理K562細胞24 h，按照上述方法進行MTT檢測K562細胞增殖抑制率，克隆形成試驗檢測細胞克隆形成情

14、況，流式細胞術檢測細胞周期分布；iso-suillin處理K562細胞3 h，western blot檢測相關蛋白表達情況。
　　9.統(tǒng)計學方法
　　實驗結(jié)果用x±s表示，用SPSS21統(tǒng)計軟件對均數(shù)作單因素方差分析（One-Way ANOVA），取P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.Iso-suillin對K562細胞全基因體轉(zhuǎn)錄譜的影響及生物信息學分析與對照組（C）相比，用藥組（T）差異表達的基

15、因有639個，其中上調(diào)443個，下調(diào)196個。上調(diào)的主要基因有ATF3、GFPT1、S100P、PHGDH、ATP2A3、NRCAM、SESN2、ATF5、LAMP3和LAD1，有多個基因與促凋亡因子相關，如多種腫瘤壞死因子基因（TNFAIP3、TNFRSF9、TNFRSF10B、TNFRSF11B）、DNA損傷誘導轉(zhuǎn)錄蛋白基因DDIT4和分化因子GDF15；下調(diào)的基因主要有MFAP3、LTNFRSF10B、SH3BP2、RUNDC3B

16、、DIP2C、SLC7A11、WARS、AAK1、ENAH、LPGAT1和EPAS1，且促有絲分裂信號成分RAS相關基因（REM1、RAB15）表達明顯降低，可能與iso-suillin對K562細胞的增殖抑制作用有關。進一步的篩選我們發(fā)現(xiàn)細胞周期激酶抑制蛋白家族成員CDKN1A（p21）的表達明顯上升。
　　Go term功能分析結(jié)果顯示，差異表達基因的產(chǎn)物主要分布在細胞質(zhì)、細胞骨架、運輸小泡、溶酶體；差異基因的分子功能主要與維

17、生素（輔酶）、酶的結(jié)合相關，同時與中性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運有關；差異基因的生物功能主要涉及到細胞凋亡、細胞程序性死亡和絲氨酸家族氨基酸代謝過程。
　　差異基因的KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，有多條信號通路與差異表達的基因相關，根據(jù)差異表達基因，我們分別列出了最可能（P值最?。┑?條差異基因的KEGG通路：甘氨酸-絲氨酸和蘇氨酸代謝、p53信號通路、胰島素信號轉(zhuǎn)導通路、葉酸的一碳庫、丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代謝、氮素代謝和氨酰tRNA生物

18、合成。P值分別為0.0004、0.0055、0.0105、0.0131、0.016、0.0352和0.0403。-lin（P-value）分別為1.31、0.49、0.41、0.43、0.44、0.25、0.25。差異基因主要在物質(zhì)代謝相關的信號通途和p53信號通路顯著富集。
　　2.MTT檢測iso-suillin對K562細胞抑制率
　　K562細胞經(jīng)1.37、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處

19、理24 h后，抑制率分別為0.28±4.21、0.16±2.59、11.23±8.33、29.32±2.35（%），組間差異顯著。結(jié)果表明：iso-suillin對K562細胞有明顯抑制，且有濃度依賴性。
　　3.軟瓊脂克隆形成試驗檢測iso-suillin對K562增殖活性的影響
　　0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理K562細胞24 h后，克隆形成率依次為39.08±13.13、25.8±

20、11.91、15.75±5.25、11.67±8.80（%）組間差異顯著；克隆大小依次為1.88±0.17、1.88±0.30、1.15±0.07、0.77±0.30（mm）。結(jié)果表明：隨iso-suillin濃度增加，克隆形成率明顯降低且克隆的面積變小。
　　4.流式細胞術檢測iso-suillin對K562細胞周期分布的影響
　　K562細胞在0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理24 h后，

21、G1期細胞占總細胞的比例為48.31±2.52％、60.27±3.67％、61.07±3.59％和67.70±2.19％；S期細胞分別為34.48±1.57％、17.98±3.09％、21.33±5.89％和18.18±7.58％；G2期細胞分別為17.22±1.76％、21.74±0.59％、17.60±2.60％和14.12±5.56％。隨著藥物濃度的增加G1期細胞所占比例明顯增加（P<0.02）；S和G2所占比例下降，有統(tǒng)計學意義

22、。
　　5.Western blot檢測iso-suillin對K562細胞增殖相關蛋白表達的影響
　　用0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理K562細胞24 h，提取總蛋白，用Western Blot檢測細胞增殖相關蛋白的表達和磷酸化情況，結(jié)果如下：與內(nèi)參蛋白β-actin比較， cyclinD相對含量為0.8072±0.0134、0.8098±0.0431、0.7388±0.0594、0.6

23、954±0.0296； CDK4分別為0.0216±0.0003、0.0202±0.0009、0.0095±0.0006、0.0038±0.0004；PCNA為0.1256±0.0027、0.0573±0.0016、0.0505±0.0026、0.0468±0.0013；p-RB1.4254±0.0358、0.7835±0.0485、0.8632±0.0399、0.2117±0.0276；E2F-10.4987±0.0423、0.275

24、4±0.0099、0.2568±0.0119、0.0419±0.0005；p210.0646±0.0032、0.1337±0.0013、0.1286±0.0009、0.1228±0.0019；p380.76410.0149、0.8479±0.0251、0.7765±0.0198、0.8378±0.0667；p38（phospho Thr180/Tyr182）0.1859±0.0025、0.1144±0.0052、0.0982±0.006

25、1、0.0911±0.0113，隨iso-suillin濃度的增加K562細胞中增殖相關蛋白cyclinD、CDK4、PCNA和E2F-1的相對含量逐漸減少，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；細胞周期蛋白依靠性激酶抑制蛋白p21的相對含量明顯升高，但p38的磷酸化程度在iso-suillin作用于K562細胞24 h明顯降低（P<0.05）。
　　用5.48μM iso-suillin作用于K562細胞0、3、6、12、24 h，提

26、取總蛋白， western測得p-p38相對含量為0.0050±0.0003、0.0411±0.0020、0.0133±0.0005、0.0036±0.0013、0.0103±0.0006；γ-H2AX的相對含量分別為0.0295±0.0032、0.0646±0.0032、0.1337±0.0013、0.1286±0.0009、0.1228±0.0019。結(jié)果顯示iso-suillin作用于K562細胞后，p38的磷酸化程度先升后降在3

27、 h時最高，γ-H2AX的相對含量逐漸升高在6 h后顯著升高。
　　6.K562細胞p53基因突變驗證
　　K562細胞中p53基因發(fā)生移碼突變，在p53蛋白編碼區(qū)序列（CDS）的406和407位點插入了一個鳥嘌呤核糖核苷酸，導至CDS序列的442-444位點提前出現(xiàn)終止密碼子TAG；用western bot無法檢測到正常p53蛋白表達，如果p53突變體被表達，其分子量大約15 Kda，但該突變體蛋白未被檢測到。
　　

28、7.P38抑制劑處理后iso-suillin對K562細胞抑制率、克隆形成率及細胞周期分布的影響
　　對照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組K562細胞的增殖抑制率分別為0、6.02±3.63、20.35±3.78、36.33±15.76(%)；克隆形成率為36.83±4.09、17.33±11.7、7.58±2.48、2.71±1.87(%)。與對照組相比，處理組細胞增殖

29、都受到了不同程度的抑制作用，但SB203580+iso-suillin與iso-suillin處理組細胞相比，SB203580+iso-suillin細胞增殖抑制作用明顯減弱，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。流式細胞術測得對照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組K562細胞的周期分布情況：G0/G1所占比例分別為39.26±1.17、43.53±0.97、44.00±1.24、65

30、.22±4.74(%)；S期32.26±2.60、25.14±2.82、26.43±4.21、18.95±3.47(%)；G2期28.47、1.43±31.33、1.86、29.58±2.98、15.83±1.28(%)。與對照組相比，處理組 G0/G1期細胞比例都有所增加，但SB203580+iso-suillin與iso-suillin處理組細胞相比，SB203580+iso-suillin組G0/G1期細胞比例明顯減少，且有統(tǒng)計學

31、意義（P<0.05）。
　　8.P38抑制劑處理后iso-suillin對K562細胞增殖相關蛋白表達的影響
　　Iso-suillin加藥3 h后，對照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組 K562細胞中相應蛋白表達量為：p21相對含量為0.4984±0.0087、0.3296±0.0603、0.2091±0.0183、1.1401±0.023；p-p38蛋白的相對含

32、量分別為0.3300±0.0052、0.1298±0.0163、0.1298±0.0164、0.1205±0.0054、0.6562±0.0312。發(fā)現(xiàn)加入p38抑制劑SB203580后p38磷酸化程度和p21相對含量明顯降低；加SB203580后，SB203580+iso-suillin處理組細胞p38磷酸化程度和p21含量相對iso-suillin處理組明顯降低，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.Is