大黃素衍生物對慢性髓細胞白血病細胞及高致瘤K562細胞裸鼠異種移植瘤的體內(nèi)外作用及機制研究.pdf

1、慢性髓細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種發(fā)生于造血干細胞的血液系統(tǒng)惡性克隆增殖性疾病。
　　大黃素(emodin)，化學名為1，3，8-三羥基-6甲基蒽醌，是從掌葉大黃的根莖中提取出的有效成分，屬天然的蒽醌類化合物，具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用。近年來大黃素的抗腫瘤活性受到了人們的關注。本課題組應用大黃素抗白血病研究已取得階段性結(jié)果，我們的研究顯示大黃素能夠有效抑制HL

2、-60、U937、HL-60/ADR、K562及其耐藥細胞株增殖、誘導細胞凋亡，該過程可能是多途徑、多分子參與的綜合網(wǎng)絡調(diào)節(jié)過程。我們在大黃素基礎上設計合成、篩選了28種大黃素衍生物，其中，衍生物E35生物活性比大黃素明顯增強。本課題初步探討大黃素衍生物E35對CML敏感及耐藥細胞株、白血病原代細胞及高致瘤K562細胞裸鼠異種移植瘤的體內(nèi)作用及相關機制，研究Bcr-Abl及其下游的信號分子在其中的表達改變。
　　課題實施分為五個部

3、分，共涉及以下幾方面內(nèi)容：
　　第一，各種大黃素衍生物對白血病細胞株的增殖影響，篩選出高效的衍生物E35。
　　方法：合成了28種大黃素衍生物，應用MTT法檢測各種大黃素衍生物對白血病細胞株增殖的影響。細胞株包括Jurkat細胞、P210Bcr-Abl表達陽性的CML細胞株K562細胞、耐IM的K562/G01細胞。
　　結(jié)果：各種大黃素衍生物對K562細胞、Jurkat細胞及K562/G01細胞的增殖抑制作用不同，部

4、分衍生物抗白血病活性較大黃素有所提高。其中，衍生物E35、E36生物活性是大黃素的10倍左右。
　　第二，大黃素衍生物E35對CML敏感及耐藥細胞株的增殖凋亡影響及其作用機制。
　　方法：(1)MTT法、集落形成實驗：檢測大黃素衍生物E35對CML敏感及耐藥細胞株增殖的影響。細胞株包括P210Bcr-Abl表達陽性的CML細胞株K562細胞、耐IM的K562/G01細胞。(2)細胞凋亡檢測：Annexin V FITC/PI

5、、DNA Ladder、DAPI分析等。(3)RT-PCR、RQ-PCR：檢測bcl-2、bax、c-myc、mcl-1、hTERT等凋亡相關基因表達水平及bcr-abl基因表達改變。(4)Western Blot：檢測P210Bcr-Abl、磷酸化 P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)及其下游信號通路的 Crkl、p-Crkl、PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信號分子表達變化，并檢測Bcl-2、Bax、Caspa

6、se3、Caspase8、Caspase9、PARP、hTERT等細胞凋亡相關蛋白表達變化。K562/G01細胞同時檢測核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM、B23、NO38或 NPM1)和核仁素(C23)等表達變化。同時與PI3K/Akt/mTOR、MAPK特異性抑制劑干預組(LY294002、Rapamycin、PD98059)進行比較。
　　結(jié)果：(1)大黃素衍生物E35對CML細胞株增殖抑制作用：①E35以時間

7、和劑量依賴方式抑制 K562細胞、K562/G01細胞增殖，對兩種細胞株的48h IC50值接近，MTT法檢測分別為2.8±0.4μmol/L、3.1±0.3μmol/L。②E35對K562細胞、K562/G01細胞集落形成的IC50平均值分別為0.23μmol/L、0.28μmol/L。(2)E35誘導CML細胞凋亡作用：①E35能夠有效誘導K562細胞、K562/G01細胞凋亡，呈量效關系。②E35作用后Bcl-2、hTERT、Pr

8、ocaspase3、Procaspase8、Procaspase9等表達下調(diào)，Caspase3、Caspase9、PARP剪切體及Bax等細胞凋亡蛋白表達上調(diào)，c-myc基因、蛋白改變不明顯。(3)E35可降低細胞P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)蛋白水平，抑制其下游的Crkl、PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號轉(zhuǎn)導通路關鍵信號活化分子p-Crkl、p-Akt、p-mTOR、p-4E

9、-BP1、p-p70S6k、p-ERK1/2等，下調(diào)方式呈時間和濃度依賴性，相應總蛋白也有不同程度下調(diào)。E35能降低K562/G01細胞B23、C23、P-gp、GST-π表達。
　　第三，大黃素衍生物E35對急性及慢性白血病原代細胞的增殖凋亡影響及其作用機制。
　　方法:(1)MTT法檢測E35對白血病原代細胞增殖的影響，以及對正常細胞的毒性。其中包括初治、復發(fā)、難治的急性白血病和CML(慢性期)。正常細胞包括正常人外周血

10、單個核細胞和人正常肝細胞LO2細胞株。(2)細胞凋亡檢測：DAPI法檢測E35對白血病原代細胞及正常細胞凋亡的影響。(3)Western Blot：檢測Bcl-2、PARP等細胞凋亡相關蛋白表達變化，檢測PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號轉(zhuǎn)導通路信號分子表達變化。
　　結(jié)果：(1)E35抑制白血病原代細胞增殖作用呈濃度依賴性，它對17例白血病患者原代細胞中位48h IC50值為5.7μmol/L(4.0-8.5μmol/L)

11、。(2)E35抑制細胞增殖作用具有一定選擇性，對正常細胞無明顯抑制作用，中位48h IC50為24μmol/L(19-34μmol/L)。(3)E35能夠誘導白血病原代細胞凋亡，并呈量效關系，對LO2誘導凋亡作用不明顯。(4)E35下調(diào)白血病原代細胞Bcl-2蛋白、PARP前體表達，上調(diào)Bax表達，同時抑制細胞PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號轉(zhuǎn)導通路關鍵信號活化分子p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6k、p

12、-ERK1/2等，相應總蛋白表達也有不同程度下調(diào)，下調(diào)方式呈量效關系。E35對難治、復發(fā)白血病原代細胞GST-π蛋白表達也有下調(diào)作用。
　　第四，大黃素衍生物E35對高致瘤K562細胞裸鼠異種移植瘤模型作用。
　　方法：(1)檢測大黃素衍生物E35對裸鼠的半數(shù)致死劑量(median lethal dose，LD50)。(2)構(gòu)建高致瘤K562細胞裸鼠異種移植瘤動物模型，將荷瘤鼠隨機分為5組：陰性對照組，100mg/kg IM

13、組，3mg/kgE35組，6mg/kgE35組，12mg/kgE35組。(3)腹腔注射每天兩次，共給藥14d，每3-4天測量瘤體大小，長徑×短徑2×0.5計算腫瘤體積相對大小。(4)血常規(guī)及肝腎功檢測；測量離體瘤塊重量，計算抑瘤率；裸鼠重要臟器和瘤塊病理組織學檢查；電鏡觀察瘤組織超微結(jié)構(gòu)。(5)Western Blot檢測瘤組織蛋白Bcl-2、PARP、P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)蛋

14、白水平及其下游 PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信號通路信號分子表達。(6)荷瘤鼠生存期觀察：將荷瘤鼠隨機分為3組，分別為陰性對照組，100mg/kg IM組及9mg/kgE35組，各組每天給藥一次，共給藥14d，其中，陰性對照組及9mg/kgE35組為腹腔給藥，100mg/kg IM組為灌胃給藥。比較各組生存率及生存時間，繪制Kaplan-Meier生存曲線。
　　結(jié)果：(1)E35對裸鼠的LD50介于60mg/kg～90

15、mg/kg之間。(2)給藥14d后，E35能顯著抑制高致瘤K562細胞裸鼠異種移植瘤生長，抑制效應呈劑量依賴性，12mg/kg E35組與IM組相比，差異無顯著性。(3)E35和IM組均能夠誘導移植瘤細胞凋亡，隨著E35作用濃度的升高，凋亡現(xiàn)象越發(fā)明顯。(4)Western Blot檢測顯示，E35在體內(nèi)能夠下調(diào)p-P210Bcr-Abl、p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6k、p-ERK1/2、p-Crkl以及B

16、cl-2表達，抑制效應呈劑量依賴性。(5)除6mg/kg E35組和12mg/kg E35組裸鼠給藥14d后WBC下降具有顯著性外，裸鼠一般狀況觀察、肝腎功檢測及重要臟器組織病理檢測顯示，E35對裸鼠無明顯毒副作用。(6)9mg/kgE35組和100mg/kgIM組荷瘤鼠42d總體生存率(overall survival，OS)、中位生存期(median survival time，MST)及最長生存時間(the longest sur

17、vivaltime)與對照組相比均明顯提高。
　　結(jié)論：(1)在大黃素基礎上設計、合成的部分大黃素衍生物的生物活性較大黃素增強，其中E35較大黃素增強10倍左右。（2）大黃素衍生物E35能夠有效抑制CML細胞株K562、K562/G01細胞增殖，并誘導細胞凋亡。(2)大黃素衍生物E35能夠抑制白血病原代細胞細胞增殖，并誘導細胞凋亡；對正常細胞的無明顯抑制作用。(4)大黃素衍生物E35在體內(nèi)可以有效抑制高致瘤K562細胞裸鼠異種移植