大黃素及其三甲氧基衍生物抑制K562細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的： 1.觀察大黃素對K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響。探討大黃素抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的分子機(jī)制。 2.通過甲基化反應(yīng)對大黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，并對新衍生物的抗腫瘤活性及其作用的分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。 方法： 1.1 MTT法檢測不同濃度大黃素處理K562細(xì)胞24h，48h，72h后細(xì)胞增殖情況。 1.2聯(lián)合應(yīng)用瑞氏染色法，AnnexinV-FITC/PI雙染法，電子顯微鏡和TUNEL法檢測

2、大黃素對K562細(xì)胞凋亡的影響。 1.3流式細(xì)胞儀測定大黃素作用K562細(xì)胞24h，48h后細(xì)胞周期變化。 1.4分光光度法測定大黃素作用K562細(xì)胞48h后Caspase-3，-8，-9活性。 1.5 RT-PCR測定大黃素作用K562細(xì)胞48h后Caspase-3 mRNA的表達(dá)。 2.1以大黃素為原料，分別通過硫酸二甲酯和碳酸二甲酯兩種不同的甲基化試劑甲基化后合成新的大黃素1，3，8-三甲氧基-6-

3、甲基蒽醌。采用HPLC及ESI-MS對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并對兩種甲基化試劑的反應(yīng)產(chǎn)率進(jìn)行比較。 2.2用不同濃度大黃素及三甲氧基衍生物溶液對K562細(xì)胞進(jìn)行處理，通過MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的改變。 結(jié)果： 1.大黃素及大黃素三甲氧基衍生物均能抑制K562細(xì)胞增殖，其作用呈現(xiàn)出一定的時(shí)效和劑量關(guān)系且低濃度下大黃素三甲氧基衍生物的抑制作用強(qiáng)于大黃素。 2.大黃素作用后的細(xì)胞在普通

4、光鏡下可見典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。40μmol/L大黃素作用K562細(xì)胞48h電子顯微鏡觀察出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，包括核固縮、核碎裂、核扭曲等，同時(shí)TUNEL法檢測可見典型的核深染細(xì)胞。Annexin V-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，40，60μmol/L大黃素作用K562細(xì)胞12h能誘導(dǎo)其凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為（8.89±0.21）％、（26.06±0.13）％，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

5、 3.大黃素作用K562細(xì)胞24h，G0/G1期細(xì)胞百分比增高，細(xì)胞阻滯于G0/G1期。三甲氧基衍生物作用K562細(xì)胞48h后，細(xì)胞周期G0/G1細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例降低。 4.40μmol/L大黃素作用K562細(xì)胞72h，Caspase-3，-8，-9活性明顯升高，與對照組比較，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 5.RT-PCR結(jié)果顯示，大黃素處理后的K562細(xì)胞，其Caspase-3mRNA表達(dá)上

6、調(diào)。 結(jié)論： 1.大黃素能抑制K562細(xì)胞增殖，其作用呈現(xiàn)出一定的時(shí)效和劑量關(guān)系。大黃素可能通過使K562細(xì)胞阻滯于G0/G1期而抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)大黃素可能通過線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，激活Caspase-9進(jìn)而活化Caspase-3及激活Caspase-8誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。 2.三甲氧基衍生物可能通過阻滯K562細(xì)胞周期由G0/G1向S期移行的機(jī)制來抑制細(xì)胞的增殖。在低濃度下，三甲氧基衍生物的