IC162對(duì)K562白血病細(xì)胞的抗腫瘤作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是以費(fèi)城染色體(Philadephia，Ph)為特征的多潛能造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，其惡性克隆的持續(xù)擴(kuò)充與細(xì)胞增殖和凋亡速率不平衡有關(guān)。CML具有特征性的染色體異位t(9，22)(q34，q11)，產(chǎn)生Bcr/abl融合基因，編碼蛋白質(zhì)P210，后者在CML的發(fā)病過程中有重要作用。研究表明，P210可促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，延緩其凋亡。對(duì)CML的治療，傳

2、統(tǒng)方法包括羥基脲、α-干擾素、異基因造血干細(xì)胞移植及新近的酪氨酸激酶抑制劑，盡管治療效果有很大改觀，但仍有某些局限。因此，尋找CML新的治療方法仍是當(dāng)前CML研究的目標(biāo)。 近年來，采用傳統(tǒng)中藥提取物治療白血病取得了較好的療效，從傳統(tǒng)中藥提取的抗白血病藥物如苦參堿(Matrine)、姜黃素(Curcumin)和冬凌草甲素(Oridonin)的體外試驗(yàn)表明可抑制多種白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示該類藥物幾乎無不良反應(yīng)。新

3、近上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院血研所的研究顯示冬凌草甲素在體內(nèi)外能誘導(dǎo)具有t(8，21)的急性粒細(xì)胞白血病M2型(AML-M2)細(xì)胞株和原代細(xì)胞凋亡，而且副作用小，是一種潛在的抗白血病藥物。因此篩選新型抗白血病的中藥有效成分，確定其抗白血病的作用并探討其機(jī)制，已成為當(dāng)今白血病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 K562細(xì)胞株系人CML急性變細(xì)胞株，既具有急性白血病細(xì)胞的特點(diǎn)，又具有CML細(xì)胞特有的本質(zhì)，因此是體外研究篩選抗白血病藥物療效及機(jī)制的良好細(xì)

4、胞模型。IC162是由某種植物提純出的單一化合物，分子量為368；具有類植物雌激素樣作用(由于商業(yè)機(jī)密原因，其具體成份尚未解密)，為了確定IC162是否有抗白血病效應(yīng)，本研究用IC162作用于K562細(xì)胞株及來自CML病人新鮮骨髓白血病細(xì)胞，觀察IC162對(duì)K562細(xì)胞和CML原代白血病細(xì)胞是否具有增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)和分化誘導(dǎo)作用；并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行探討。 第一部分IC162對(duì)CML細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng) 目的：觀察IC16

5、2對(duì)K562細(xì)胞和CML原代細(xì)胞增殖以及細(xì)胞分裂周期的影響。 方法：用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)、MTT試驗(yàn)、集落形成抑制試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析K562細(xì)胞增殖能力及DNA含量，觀察不同濃度的IC162對(duì)CML細(xì)胞(K562細(xì)胞或CML原代細(xì)胞)增殖的抑制率、集落形成和對(duì)細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果：(1)IC162以濃度依賴性方式有效地抑制CML細(xì)胞增殖，IC162抑制K562細(xì)胞活力的IC50為8.2μmol/L；(2)IC162能顯著

6、抑制K562細(xì)胞集落形成，并呈量效關(guān)系；(3)IC162增加G0/G1期K562細(xì)胞百分率，降低S期K562細(xì)胞百分率。 結(jié)論：IC162能夠有效地抑制CML細(xì)胞增殖，并呈藥物濃度和時(shí)間依賴性，IC162可阻滯CML細(xì)胞在G0/G1期從而抑制CML細(xì)胞增殖。 第二部分 IC162對(duì)CML細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) 目的：確定IC162能否誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡。 方法：用不同濃度的IC162作用于K562和CML原代

7、細(xì)胞，采用Hochest33258染色法和AnnexinV-FITC/PI染色法檢測凋亡細(xì)胞的百分率；用Western印跡檢測IC162干預(yù)后的K562細(xì)胞Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果：(1)兩種檢測方法均證明IC162能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡；(2)IC162誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡伴有Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)和裂解激活。 結(jié)論：IC162能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡；其誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋

8、亡的分子機(jī)制與Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)和裂解激活有關(guān)。 第三部分 IC162對(duì)K562細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。 目的：確定IC162對(duì)K562細(xì)胞是否具有分化誘導(dǎo)潛能。 方法：用IC162(1～12μmol/L)作用于K562細(xì)胞3～6d，采用瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白測定、細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測K562細(xì)胞膜CD71和HIR2分化抗原，從而評(píng)價(jià)IC162對(duì)K562細(xì)胞

9、的分化誘導(dǎo)作用。 結(jié)果：8μmol/L的IC162可明顯升高K562細(xì)胞內(nèi)Hb含量；上調(diào)K562細(xì)胞膜CD71和HIR2分化抗原的表達(dá)量；并在形態(tài)上有趨向分化的改變。 結(jié)論：低劑量IC162有誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化的作用。 第四部分 IC162對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的分子機(jī)制 目的：觀察IC162作用下K562細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)過程中NF-kB、STAT3、STAT5b、及JAK

10、2等增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化、MMP-9mRNA表達(dá)變化及NF-kB細(xì)胞內(nèi)分布，部分揭示IC162抗白血病作用的分子機(jī)制。 方法：(1)用Western blot分析IC162作用下K562細(xì)胞NF-k B、I k B、STAT3、STAT5b、JAK2、P-NF-xB、P-STAT1和P-STAT5蛋白質(zhì)表達(dá)水平，(2)Real-time PCR定量檢測MMP-9mRNA的表達(dá)量，(3)用間接免疫熒光技術(shù)觀察NF-kB