PTPa對人紅白血病細胞K562影響的基礎(chǔ)研究.pdf

1、PTPα屬于包含兩個PTP催化域的受體類亞家族(RPTPs) ,大小約130kDa，分布較廣泛，含有一個短的高糖基化胞外受體結(jié)合區(qū),一個跨膜區(qū)和兩個胞內(nèi)的PTP催化區(qū)(D1，D2)。PTPα高表達所導(dǎo)致的效應(yīng)表現(xiàn)比較復(fù)雜。在成纖維細胞中，持續(xù)的過表達PTPα具有使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的能力，在細胞內(nèi)發(fā)揮癌基因的功能。人乳腺癌細胞系MCF7和N202中PTPα又具有抑癌基因的功能。因此，在不同的細胞或同一細胞的不同狀態(tài)，PTPα所起的作用可能不同

2、。 本研究首先檢測了蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶α（PTPα）在血液腫瘤細胞中的特異性表達，通過RT-PCR和western blot檢測三種不同類型造血系腫瘤細胞（K562、NB4、Jurkat T）中PTPα的表達水平。根據(jù)實驗結(jié)果選取了表達相對較低的人紅白血病細胞K562作為過量表達研究對象，利用脂質(zhì)體將受四環(huán)素調(diào)節(jié)的PTPа基因質(zhì)粒表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)染K562細胞，通過G418篩選獲得穩(wěn)定過表達PTPа的陽性細胞克隆，經(jīng)RT-PCR和w

3、estern blot驗證過表達情況；收集細胞經(jīng)MTT法檢測細胞增值情況；流式細胞儀檢測細胞周期分布和細胞分化狀態(tài)。并將陽性克隆細胞皮下接種裸鼠，觀察PTPа基因轉(zhuǎn)染前后K562細胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤能力及生長狀況。通過G418的長期篩選和western blot實驗的驗證，我們獲得了PTPα高表達多克隆細胞系K562-PTPа。體外增殖實驗結(jié)果表明,實驗組K562-PTPα細胞與未轉(zhuǎn)染組K562細胞和轉(zhuǎn)染空載體組K562-splice細

4、胞相比，生長速度增快，G2/M期細胞比例增加(P<0.05)，而細胞分化無明顯變化。裸鼠體內(nèi)致瘤能力實驗顯示,K562組、K562-splice組和K562-PTPα組平均瘤重分別為(1.1±0.32)g、(1.3±0.24)g和(2.5±0.48)g；病理切片顯示K562-PTPα組瘤體組織分化程度較對照組低、惡性程度高，細胞的致瘤能力增強(P<0.01)。綜上所述，本部分實驗首次證實了過表達PTPα使K562細胞具有更強的體外增殖能

5、力和體內(nèi)致瘤能力，表明PTPα可能在造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進作用。 PI3Kγ是屬于IB類PI3K，由ｐ110γ催化亞基和p101或p87調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，其通過G蛋白偶聯(lián)受體或G蛋白直接激活，具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性。PI3Kγ主要表達于造血系細胞，參與包括MAKP、JNK在內(nèi)的眾多信號傳導(dǎo)通路的激活。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)通過維甲酸類受體(ret

6、inoic acid receptor，RAR)參與很多基因的調(diào)控，從而參與細胞的增殖和分化。既往研究發(fā)現(xiàn)，ATRA在誘導(dǎo)人紅白血病細胞K562體外分化過程中，PI3Kγ基因的表達以維甲酸濃度梯度依賴的模式在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)，但其上調(diào)的機制并不清楚。 在第一部分初步探討了過表達PTPα對K562細胞影響的基礎(chǔ)上，本實驗第二部分則通過體外免疫共沉淀技術(shù)對PTPα在K562細胞內(nèi)的功能進行進一步研究。首先通過ATR

7、A誘導(dǎo)K562細胞，經(jīng)Western blot檢測在K562細胞中，ATRA是否可以上調(diào)PI3Kγ的表達；其次，抽取細胞總蛋白質(zhì)做免疫共沉淀實驗，檢測是否有PI3Kγ和PTPα復(fù)合物的形成，然后進一步觀察ATRA處理細胞后是否會影響到PI3Kγ、PTPα相互作用。經(jīng)ATRA誘導(dǎo)細胞后，Western blot結(jié)果證實在K562細胞內(nèi)，ATRA可以上調(diào)PI3Kγ的表達，這也符合了本科室及其他研究者以往的研究結(jié)果；同時，免疫共沉淀實驗表明，

8、在K562細胞內(nèi)，PI3Kγ和PTPα是相互結(jié)合的，而且這種相互作用可以經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后增強，但對于兩者相互結(jié)合的具體機制及是否為直接結(jié)合還是間接結(jié)合還需進一步研究證實。本部分為探討和進一步闡明PTPα的功能打下基礎(chǔ)。 綜上所述，本研究從PTPα和PI3Kγ這兩個酶出發(fā)，以人紅白血病細胞K562為研究基礎(chǔ)，分兩個部分初步研究了PTPα對人造血系惡性腫瘤細胞的影響和在人紅白血病細胞K562內(nèi)PTPα與PI3Kγ兩者的相互作用及A