水通道蛋白1基因?qū)Π籽562細胞紅系分化的影響.pdf

1、背景和目的：
　　 白血病是世界范圍內(nèi)常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種細胞分化障礙性疾病，其核心問題是白血病細胞失去進一步分化為成熟細胞的能力而停滯在細胞發(fā)育的不同階段。人紅白血病細胞株K562最初源于一位慢性髓性白血病患者的胸膜滲出液，K562細胞攜有Ph染色體t(9;22)(q34; q21)，9號染色體abl基因與22號染色體bcr基因由于染色體異常重組形成bcr/abl融合基因，翻譯產(chǎn)生P210蛋白，該蛋白是致病的主要原因

2、，其具有增強酪氨酸激酶的活性。K562細胞在體外可被誘導向紅系分化，表現(xiàn)為抑制該細胞的惡性增殖能力，以及具有相應的紅系成熟標志。以β-珠蛋白是否表達來判斷其是否真正的向紅系細胞方向分化。研究證明，小鼠紅白血病細胞(MEL)、K562細胞、人早幼粒白血病HL-60細胞等造血系統(tǒng)腫瘤細胞，都可以通過誘導分化劑在體外促進其向終末方向分化，并表達終末分化產(chǎn)物，從而使這些腫瘤細胞失去惡性增殖的能力。因此利用誘導分化物使癌細胞的增殖和基因的活動趨于

3、正常，使基因表達亦趨于正常，為腫瘤的治療領域提供了新策略。
　　 目前誘導分化療法是腫瘤研究的新領域，尤其是白血病的治療，使惡性腫瘤細胞能夠在體內(nèi)外分化誘導劑的作用下向正常細胞方向分化逆轉(zhuǎn)。K562細胞是體外研究腫瘤細胞惡性表達調(diào)控的極好模型，因為他能夠向多種血細胞系方向分化。因此分化策略主要是將K562細胞向紅系方向誘導分化。其中，全反式維甲酸誘導分化治療已成為治療急性早幼粒細胞白血病(Acute promyelocytic

4、leukemia，APL)的首選手段。隨著對白血病誘導分化機制的深入研究和動物實驗的開展，誘導分化療法將成為白血病臨床治療的主攻方向，但目前仍有諸多問題阻礙著其應用:1、誘導分化的具體機制尚未明確;2、誘導分化劑本身毒副作用大。因此白血病誘導分化相關基因或治療靶點的發(fā)現(xiàn)將是解決這些問題的突破點。
　　 水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一組小分子跨膜蛋白家族，參與水的快速跨膜轉(zhuǎn)運。對于水通道蛋白的認識最開始主要是基于AQ

5、P1的結構分析，AQP1是第一個被發(fā)現(xiàn)的AQPs蛋白，Agre因此獲得了2003年的諾貝爾化學獎，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)哺乳動物水通道家族有13個成員(AQP0—AQP12)，其基因結構、基因表達調(diào)控、染色體定位、蛋白結構、組織分布和生理功能均得到了較為深入的研究。AQP1能使紅細胞適應環(huán)境中血漿的滲透壓變化，通過調(diào)節(jié)水的運輸使紅細胞膨脹或皺縮。促紅細胞生成素可使紅細胞容積瞬間增高，胞膜AQP1密度也大大增高。研究發(fā)現(xiàn)氧氣除了在紅細胞膜上自由擴散

6、，也能夠在AQP1運輸和擴散。因此AQP1既是紅細胞胞內(nèi)胞外水進出交換的通道，同樣也是紅細胞運輸和交換氣體的通道，AQP1不僅是水通道蛋白，還是氧氣氧分子進出細胞的通道。
　　 大量研究顯示AQP1的功能或表達異常與多種腫瘤的發(fā)生關系密切。用丁酸鹽誘導HEL細胞向紅系分化后，AQP1的轉(zhuǎn)錄表達明顯增加，在人紅白血病K562細胞中也出現(xiàn)了同樣的結果。重要的是在AQP1啟動子中包含CACCC元件，該元件具有紅細胞特異性，并且AQP1

7、啟動子的活性在K562和HEL細胞中是非紅系細胞的24倍。無論是9-順式維甲酸(9-cisretinoic acid)還是全反式維甲酸(all-transretinoic acid)，AQP1啟動子中含有的維甲酸(retinoic acid，RA)反應元件可通過與RA結合誘導人紅白血病細胞細胞表達AQP1，并且隨著RA劑量增加，AQP1的表達明顯增加，維甲酸誘導的AQP1蛋白主要在細胞質(zhì)膜上表達。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)除了RA，二甲亞砜和皮

8、質(zhì)類固醇亦可誘導小鼠MEL細胞表達AQP1。以上研究可以看出多種促紅系分化的藥物都可增強AQP1的表達，說明紅白血病細胞的紅系分化調(diào)控和AQP1的表達可能有著密切聯(lián)系。
　　 目前對于AQP1基因的功能研究還多局限于與液體吸收或分泌有關的上皮細胞及可能協(xié)同水跨細胞轉(zhuǎn)運的內(nèi)皮細胞中。AQP1高表達在紅白血病細胞向紅系分化過程的作用如何及其具體機制，有待進一步研究。因此在以前的研究基礎上，結合國內(nèi)外文獻資料，首次將AQP1作為靶基因

9、，構建AQP1基因的真核表達重組載體，在K562細胞中穩(wěn)定表達，同時采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體shRNA表達系統(tǒng)對K562細胞中AQP1基因表達進行長效抑制，研究AQP1的高表達和表達抑制對K562細胞向紅系分化過程及生理生化各項指標的影響，深入研究AQP1基因在細胞誘導分化中的功能，以期進一步明確AQP1基因與白血病發(fā)生機制之間的關系，為臨床誘導分化治療白血病提供新的治療靶點。
　　 目的：
　　 確定AQP1與K562細胞紅

10、系分化的相關性。構建穩(wěn)定表達AQP1基因的K562-AQP1細胞系以及穩(wěn)定抑制AQP1基因表達的K562-shAQP1細胞系。比較三種不同細胞系K562、K562-AQP1、K562-shAQP1在腫瘤細胞誘導分化、生長增殖等方面的差異，明確AQP1基因的在紅系分化中的新功能。應用生物信息學方法比較K562細胞與AQP1表達增高或降低的K562細胞中大量相關基因表達的變化，從而發(fā)現(xiàn)一組疾病相關基因在特定條件下的相互作用，為臨床誘導分化治

11、療白血病提供一組新的治療靶點。
　　 方法：
　　 1.使用RA處理K562細胞，收集24 h、48 h及72 h的細胞，同時設立未加RA的K562細胞為對照組。采用RA誘導K562細胞向紅系分化之后，通過Real-time PCR法檢測紅系指標γ-globin的表達變化;分光光度法檢測血紅蛋白(hemoglobin)含量，研究RA對K562細胞紅系分化的影響。為了研究APQ1基因與K562細胞紅系分化的關聯(lián)，使用Rea

12、l-time PCR法、蛋白質(zhì)印跡法檢測RA誘導后K562細胞AQP1 mRNA和蛋白表達水平。
　　 2.以人腦cDNA文庫為模板，通過PCR擴增出AQP1基因的編碼序列，構建pBABE-puro-AQP1真核表達載體;轉(zhuǎn)染K562細胞，篩選建立穩(wěn)定過表達AQP1基因的K562細胞株(K562-AQP1); real-time PCR法、細胞免疫熒光染色法及蛋白質(zhì)印跡法檢測AQP1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平。通過MTT法檢測細胞生長增

13、殖、real-time PCR法檢測紅系指標γ-globin表達和分光光度法檢測血紅蛋白含量，研究AQP1過表達對K562細胞紅系分化、增殖的影響。
　　 3.設計特異AQP1 shRNA序列，構建pSUPER-retro-puro重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染K562細胞，篩選建立穩(wěn)定抑制AQP1基因表達的K562細胞株(K562-shAQP1); real-time PCR法、細胞免疫熒光染色法及蛋白質(zhì)印跡法檢測AQP1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平。

14、通過Real-time PCR和紫外分光光度計法比較K562-shAQP1細胞株與對照組細胞在RA誘導后紅系指標γ-globin和hemoglobin的表達，研究AQP1在RA誘導K562細胞紅系分化中的作用，能否阻斷RA誘導的K562細胞紅系分化。
　　 4.比較三種不同細胞系K562、K562-AQP1、K562-shAQP1在腫瘤細胞誘導分化、生長增殖等方面的差異，明確AQP1基因的在紅系分化中的新功能。
　　 5

15、.利用K562細胞和AQP1過表達的K562細胞所生成的全基因組表達譜芯片，獲取共同表達差異基因，然后應用GO、Pathway等生物信息學方法比較相關基因表達的變化，從而發(fā)現(xiàn)一組白血病相關基因在特定條件下的相互作用，為臨床誘導分化治療白血病提供一組新的治療靶點。
　　 6.本文統(tǒng)計分析采用SPSS13.0。計量資料的統(tǒng)計描述用均數(shù)±標準差的形式給出，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較的情況下用one-way ANOVA，重復

16、測量資料采用重復資料的方差分析;兩兩之間的比較，方差齊時用LSD法，不齊則用Dunnett's T3檢驗法。檢驗水準設為P＜0.05。
　　 結果：
　　 1.RA體外誘導K562細胞紅系分化Real-time PCR檢測RA處理K562細胞不同時間后紅系分化指標γ-globin mRNA的表達增加，48 h時表達增加最顯著（可達未加RA處理組的10.05倍），且差異具有統(tǒng)計學意義（F=20.191，P=0.008）。紫

17、外分光光度計法進行K562細胞hemoglobin含量的測定結果顯示，RA誘導后的K562細胞hemoglobin含量較對照K562細胞增加，且隨RA作用時間延長含量遞增，差異具有統(tǒng)計學意義（F=651.197，P＜0.001）。
　　 2.AQP1基因表達與K562細胞紅系分化的相關性Real-time PCR檢測RA誘導K562細胞紅系分化后AQP1基因mRNA的表達較對照組均有所增加（24h、48h、72h與對照組相比分別

18、為8.23、12.81、12.57倍），不同水平間差異具有統(tǒng)計學意義（F=18.834，P=0.009）;Westernblot結果也顯示AQP1蛋白表達量也隨RA作用時間延長而遞增。
　　 3.AQP1基因穩(wěn)定過表達與K562細胞紅系分化和增殖成功構建AQP1基因的真核表達載體之后，使用免疫組化法鑒定K562細胞中AQP1的表達。AQP1經(jīng)一抗孵育后用goat anti-rabbit IgG-R熒光二抗顯色為紅色，DAPI進行

19、核復染顯色為藍色，將抗原顯色部分與核染色部分疊加在一起觀察抗原表達的變化。結果顯示K562-AQP1細胞中紅色熒光較對照組K562細胞增強，表明pBaBb-puro-AQP1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染K562細胞后，AQP1蛋白在細胞中的表達增多。
　　 Real-time PCR和Western blot檢測K562-AQP1細胞中AQP1 mRNA和蛋白表達情況。Real-time PCR檢測結果顯示K562-AQP1細胞中AQP1

20、mRNA的表達較對照組增加，較對照細胞增高700倍以上，且差異具有統(tǒng)計學意義（t=24.845，P=0.002）;Western blot結果顯示K562-AQP1細胞中AQP1蛋白表達量也有所增加。
　　 Real-time PCR結果顯示，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP1基因真核表達載體的K562-AQP1細胞中γ-globin mRNA的表達較對照K562細胞有所增加(7.369∶1)，且差異具有統(tǒng)計學意義(t=24.965，P=0.0

21、01)。紫外分光光度計法的測定結果顯示，AQP1穩(wěn)定過表達細胞株血紅蛋白含量較對照K562細胞有所增加（增加49％），差異具有統(tǒng)計學意義(t=26.561，P＜0.001)。
　　 MTT法檢測K562-AQP1細胞的生長曲線結果顯示，AQP1過表達組(K562-AQP1)較對照組(K562)細胞的生長速度降低（F=171.36，P=0.001），說明AQP1在促進K562細胞向紅系分化的同時對細胞增殖有抑制作用。
　　

22、 4.AQP1基因表達抑制與K562細胞誘導分化篩選建立穩(wěn)定抑制AQP1基因表達的K562細胞株(K562-shAQP1)之后，細胞免疫熒光染色法檢測AQP1在K562細胞中的表達改變結果顯示，AQP1熒光顯色為紅色，定位在細胞膜上，K562-shAQP1細胞膜上紅色熒光較對照組K562細胞有所減少，表明pSUPERretro-puro-shAQP1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染K562細胞后，AQP1蛋白在細胞中的表達受到抑制。
　　 用

23、Real-time PCR法檢測K562-shAQP1細胞中AQP1基因mRNA的表達結果顯示，K562-shAQP1細胞中AQP1 mRNA的表達較對照組有所下降，表達量約為對照組的27％，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-34.138，P=0.001);Western blot結果顯示K562-shAQP1細胞中AQP1蛋白表達量也有所降低，Bandleade軟件分析內(nèi)對照GAPDH與目的蛋白條帶灰度比，抑制效率達89.8％。
　　

24、 通過比較K562-shAQP1細胞株與對照組細胞在RA誘導后紅系指標γ-globin和hemoglobin的表達，研究AQP1在RA誘導K562細胞紅系分化中的作用，能否阻斷RA誘導的K562細胞紅系分化。用Real-time PCR法檢測γ-globin mRNA表達結果顯示，RA作用于AQP1表達下調(diào)的K562-shAQP1細胞系24h、48h、72h的γ-globin mRNA表達量為2.348、2.926、2.836，與RA處

25、理的對照K562細胞組(6.709、9.561、8.284)相比有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義（F=53.062，P＜0.001）。紫外分光光度計法的測定結果顯示，RA處理的K562-shAQP1細胞系hemoglobin含量與RA處理的對照K562細胞比較也有有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義（F=1.736，P=0.177）。當RA誘導K562細胞紅系分化時，下調(diào)AQP1表達可抑制RA的誘導分化作用。
　　 5.應用全基因組表達譜芯

26、片分析AQP1基因?qū)562細胞紅系誘導分化的作用機制本研究重點分析K562組與K562-AQP1組之間的差異表達基因，其中363個基因表達上調(diào)，421個基因表達下調(diào)。這些差異表達基因的GO分類有317個，分析發(fā)現(xiàn)差異基因的生物學途徑主要與氧氣運輸、程序性凋亡以及紅系分化等相關;分子功能則與氧氣運輸活性相關，證實AQP1基因的過表達確實能促進紅系分化并且在該進程中發(fā)生細胞凋亡;差異表達基因的細胞組成多為血紅蛋白復合物，證實AQP1過表達

27、能顯著增加K562細胞血紅蛋白的表達，表現(xiàn)出紅系分化的顯著特征。
　　 將K562組和K562-AQP1組共同上調(diào)和下調(diào)的基因經(jīng)過整理篩選，上傳至STRING分析這兩組的差異基因所編碼蛋白質(zhì)的相互關系，結果發(fā)現(xiàn)有24個基因編碼的蛋白質(zhì)的相互作用主要集中在核心位置。將上述24個基因上傳至pSTIING工具，進一步分析這些基因及其轉(zhuǎn)錄因子的網(wǎng)絡拓撲結構，其中7個差異基因仍然處在重要結點位置，分別是:POLR2L、SOS1、CDKN1

28、A、PIN1、NCOA3、ATF3、FOS。再根據(jù)參與重要分子通路的基因、以及在重要GO term有所富集的基因使用pSTIING工具進行網(wǎng)絡圖譜的構建，有5個基因位于重要結點位置，分別是:TRIB3、CDKN1A、DDIT3、ATF3、ALCAM。最終將這12個基因?qū)⑦M行下一步的文獻挖掘，以探討與白血病以及紅系分化之間的聯(lián)系。
　　 FACTA文本挖掘工具對10個差異表達基因進行進一步的分析比較，結果發(fā)現(xiàn)，其中大部分都與白血病

29、相關，并且大多數(shù)基因存在大量的相關文獻報道，為白血病紅系分化分子靶標的篩選提供明確有力的支持。相關文獻挖掘的結果發(fā)現(xiàn)FOS、ATF3在白血病中高表達，促進白血病細胞的增殖;SOS1、NCOA3這2個基因經(jīng)文獻查閱跟白血病沒有直接關系，但是通過信號通路或者與相關基因融合而參與白血病的發(fā)生，在白血病的治療以及預后起到負面作用;并且這4個基因在本研究中均發(fā)生了下調(diào)。另外，與紅系分化相關的血紅蛋白HBD、HBE1、HBG2、HBQ1在K562-

30、AQP1細胞中均差異表達上調(diào)，其中HBD基因的差異表達最顯著，因此推測AQP1與血紅蛋白表達關系密切，并且在紅系分化過程中存在著共表達作用。
　　 預計后期再加以實驗驗證。下一步再加上AQP1表達抑制的表達譜芯片進行共同研究，從中再篩選出特異性和實用性更強的基因，作為白血病臨床診斷的分子靶標候選基因。還要確定AQP1參與的信號通路以及如何發(fā)揮誘導血紅蛋白表達的功能。
　　 結論：
　　 本研究通過基因增加、基因抑

31、制、Real-time PCR、Western Blot等分子生物學方法，采用γ-珠蛋白、血紅蛋白表達，細胞增殖曲線作為紅系分化檢測指標，對水通道蛋白1（AQP1基因）在K562細胞紅系分化中的作用進行了研究，取得以下研究結果:
　　 1.維甲酸(RA)誘導K562細胞紅系分化的過程中，紅系分化指標γ-珠蛋白、血紅蛋白表達均明顯增加;并且AQP1 mRNA及蛋白的表達顯著增加。確定了AQP1表達與K562細胞紅系分化的相關性;<

32、br>　　 2.通過構建pBABE-puro-AQP1真核表達載體確定了AQP1過表達可以顯著促進K562細胞向紅系分化，同時抑制細胞增殖。
　　 3.AQP1基因的表達抑制可部分阻斷RA誘導的紅系分化作用，證實AQP1基因在RA誘導K562細胞紅系分化過程中發(fā)揮重要作用，提示AQP1基因可能作為治療紅白血病新的靶基因。
　　 4.以K562-AQP1和K562為對象，利用全基因組表達譜芯片獲取差異表達基因進行分析。選

33、取8個與AQP1基因相關的基因，分別是:差異表達下調(diào)基因FOS、ATF3、SOS1、NCOA3，以及差異表達上調(diào)基因HBD、HBE1、HBG2、HBQ1。推測這些基因與紅系分化相關，預計后期再加以實驗驗證并進行深入研究。
　　 本研究的創(chuàng)新之處1.研究AQP1的表達變化在紅白血病細胞紅系誘導分化中的作用及機制，國內(nèi)外未見報道，有明顯創(chuàng)新。
　　 2.本課題從基因增強、基因抑制正反兩個方面研究AQP1的作用，采用高特異性的