重組人核心蛋白聚糖對白血病K562細胞體外影響的實驗研究.pdf

1、本文對重組人核心蛋白聚糖對白血病K562細胞體外影響進行了實驗研究。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：重組人核心蛋白聚糖對K562細胞增殖及凋亡作用的實驗研究。
　　 目的：觀察重組人核心蛋白聚糖(rhDCN)對白血病K562細胞生長抑制、凋亡的影響，并探討可能的作用機制。
　　 方法：⑴將已構建好的pcDNA3.1(+)-DCN真核表達載體經(jīng)EcoRI、NotI雙酶切、測序鑒定。⑵鑒定正確的重組質粒大量純化

2、擴增后，通過LipofectamineTm2000脂質體介導轉染對數(shù)生長期的白血病K562細胞，提取轉染后48h細胞的總RNA，并進行RT-PCR鑒定。⑶試驗分為0.9％NaCl溶液組、pcDNA3.1(+)/K562組、pcDNA3.1(+)-DCN/K562組和脂質體組。⑷經(jīng)瑞特染色觀察轉染后細胞形態(tài)的改變，MTT法檢測細胞增殖活性，碘化丙啶(PI)染色，流式細胞術分析細胞周期及凋亡。5.Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白

3、BCL-XL、Mcl-1及Bax的表達。
　　 結果：①重組質粒雙酶切后，所得基因片斷與預期基因片斷大小相符；測序結果與Genebank中的DCN基因序列完全相符，無突變。②通過脂質體轉染法將pcDNA3.1(+)-DCN重組質粒轉入K562細胞后，RT-PCR結果證實轉染成功。③pcDNA3.1(+)-DCN/K562組瑞特染色呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變，其他各組無明顯凋亡形態(tài)學改變。④MTT結果顯示，pcDNA3.1(+)-D

4、CN/K562組細胞增殖抑制率(轉染24h為16±1.08％，轉染48h為14±1.01％，轉染72h為20±1.19％)明顯高于對應時間點其他組增殖抑制率，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；FCM檢測結果顯示，pcDNA3.1(+)-DCN/K562組凋亡率(20.15±1.31％)、細胞的G0/G1期細胞百分率(51.15±0.57％)與其他各組結果比較增加明顯，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。⑤Western blot結果顯示p

5、cDNA3.1(+)-DCN/K562組與其他各組比較BCL-XL、Mcl-1蛋白表達減低，Bax蛋白表達升高。
　　 結論：rhDCN重組質?？捎行б种芀562細胞增殖，并誘導其凋亡。rhDCN對細胞周期及凋亡相關蛋白BCL-XL、Mcl-1、Bax的影響可能是其發(fā)揮作用的機制，為白血病生物治療提供了新的實驗依據(jù)。
　　 第二部分：重組人核心蛋白聚糖基因增強多柔比星對K562細胞作用的實驗研究
　　 目的：研究

6、重組人核心蛋白聚糖(rhDCN)聯(lián)合多柔比星(ADM)對白血病K562細胞生長的影響，并分析其可能機制。
　　 方法：用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)K562細胞，經(jīng)脂質體介導轉染對數(shù)生長期的K562細胞，試驗分為0.9％NaCl溶液組、pcDNA3.1(+)-DCN/K562組、ADM/K562組、pcDNA3.1(+)-DCN加ADM/K562組。瑞特染色觀察細胞形態(tài)學改變；采用MTT法檢測細胞增殖活性；流

7、式細胞術(FCM)Annexinv/PI雙染色，分析細胞凋亡；采用RT-PCR法分析各處理組K562細胞TGF-β1 mRNA水平表達的變化。
　　 結果：pcDNA3.1(+)-DCN加ADM/K562組細胞比單獨DCN和ADM組細胞，染色呈現(xiàn)更顯著的凋亡形態(tài)學改變；MTT結果顯示聯(lián)合組細胞增殖抑制率(61±1.32％)明顯高于單獨干預組(DCN組20±1.9％；ADM組47±1.04％)(P＜0.05)，F(xiàn)CM檢測結果顯示聯(lián)