PPARγ配體對白血病K562細胞的生長抑制作用及其對TLRs表達的影響研究.pdf

1、過氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferators—activated receptor，PPAR)γ是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族成員。激活的PPARγ與核內(nèi)的維甲酸X受體結(jié)合形成異源二聚體，再與靶基因的啟動子中PPAR反應(yīng)元件相結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。PPARγ主要調(diào)控脂質(zhì)代謝和脂肪細胞分化，也參與糖類代謝、細胞周期調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化、細胞凋亡等病理生理過程。研究報道PPARγ激

2、動劑對多種腫瘤細胞具有抑制細胞生長和誘導細胞凋亡作用，早期研究顯示在許多血液細胞中可檢測到PPARγ的表達，而且在人髓系和淋系白血病細胞中也可檢測到PPARγ的表達。盡管大量資料顯示PPARγ激動劑具有潛在的抗腫瘤作用，但具體作用機制尚不十分清楚。最初認為PPARγ激動劑是通過調(diào)節(jié)PPARγ介導的靶基因的表達來抑制腫瘤細胞增殖。然而近年來有研究表明，在一些腫瘤中PPARγ激動劑是通過PPARγ非依賴途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。 Tol

3、l樣受體(Toll—like receptors，TLRs)是天然免疫反應(yīng)中抵抗病原微生物入侵機體的第一道防線。至今已發(fā)現(xiàn)哺乳動物中TLRs家族有11個成員。每個TLR都可識別不同的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。當病原體入侵機體后TLR特異性識別PAMP，通過髓樣分化蛋白88、IL-1受體相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6等各種轉(zhuǎn)接分子介導的信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)

4、揮生物學效應(yīng)。TLR2、4可分布于各種腫瘤細胞，參與腫瘤免疫監(jiān)視，并對腫瘤的生長發(fā)揮作用。最近研究報道TLR2、4可以通過NF—к B途徑調(diào)節(jié)干細胞的增殖與細胞凋亡。但TLR2、4在K562細胞中的表達尚未見資料報道。 目的：觀察PPARγ激動劑羅格列酮(RGZ)聯(lián)合拮抗劑GW9662對人慢性髓系白血病K562細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響以及對PPARγ和TLR2、4表達的調(diào)節(jié)作用，探討PPARγ途徑在RGZ誘導K562細胞凋

5、亡和生長抑制機制中的作用，并試圖揭示TLR信號通路在PPARγ非依賴途徑中的作用。 方法：采用人慢性髓系白血病K562細胞株為靶細胞，實驗分四組：40μmol/LRGZ組、10μmol/L GW9662組、聯(lián)合用藥組(40μmol/L RGZ+10μmol/L GW9662)、對照組(未加藥)。1.分別用不同濃度的RG2(20-80μmol/L)、GW9662(1，10μmol/L)、40μmol/LRGZ聯(lián)合GW9662(1，

6、10μmol/L)處理細胞24、48及72小時后，采用噻唑藍(MTT)比色法檢測各組細胞生長抑制作用。2運.用瑞氏—姬姆薩染色法油鏡下觀察各組48小時后細胞形態(tài)學改變。3.采用Annexin V/PI雙染流式細胞儀分別測定各組24、48、72小時的細胞凋亡率。4.PI染色流式細胞儀分析各組72小時后對細胞周期的影響。5.RT—PCR法檢測對照組PPARγ和TLR2、4表達水平，以及各給藥組24、48、72小時對PPARγ mRNA表達的

7、影響。6.采用直接免疫熒光法流式細胞儀檢測各組48小時后對TLR2、4蛋白表達的影響。7.SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，采用單因素方差分析，以P<0.05為統(tǒng)計學顯著性意義標準。 結(jié)果：1.MTT結(jié)果顯示：40μmol/L以上的RGZ組較對照組呈時間、劑量性抑制K562細胞的生長(P<0.05)；1μmol/L GW9662組較對照組基本上無顯著性差異；40μmol/L RGZ聯(lián)合10μmol/L GW9662組較40μ

8、mol/L RGZ組更顯著的抑制細胞生長(P<0.05)。2.瑞氏—姬姆薩染色油鏡下觀察，對照組可見K562細胞形態(tài)均一，胞膜完整，染色質(zhì)分布均勻；40μmol/L RGZ組和10μmol/L GW9662組多可見細胞體積變小，出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)濃縮、邊緣化等細胞早期凋亡的改變；聯(lián)合用藥組則可見細胞核裂解、出現(xiàn)凋亡小體等晚期凋亡的改變。3.FCM檢測細胞凋亡結(jié)果顯示：40μmol/L RGZ組和10μmol/L GW9662組較對照組

9、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；40μmol/LRGZ聯(lián)合10μmol/L GW9662誘導K562細胞凋亡呈現(xiàn)時間依賴性，于72h時細胞凋亡率達50％以上，高于兩種藥物單用時的凋亡率。4.FCM檢測細胞周期結(jié)果顯示：40μmol/L RGZ組和10μmol/L GW9662組較對照組G0/G1期細胞的比例增高同時S期細胞比例降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組G0/G1期細胞的比例較單用藥組有所升高。5.RT—PCR顯

10、示：較對照組相比，40μmol/L RGZ組呈時間性明顯上調(diào)PPARγ表達，10μmol/L GW9662組對PPARγ表達無影響，而聯(lián)合用藥組PPARγ表達較單用RGZ明顯下降。6.直接免疫熒光法顯示：TLR2、4在對照組中表達的陽性細胞率分別為(7.91±0.53)％和(83.26±0.34)％；與對照組比較，48h聯(lián)合用藥組及單用RGZ、GW9662組TLR2表達的陽性細胞率升高，TLR4表達的陽性細胞率下降。 結(jié)論：1.