和厚樸酚對(duì)白血病細(xì)胞株K562增殖與凋亡影響的研究.pdf

1、目的:白血病細(xì)胞同其他腫瘤細(xì)胞一樣,具有逃逸細(xì)胞周期調(diào)控、無(wú)限增殖的特點(diǎn),誘導(dǎo)其凋亡是目前治療白血病的主要方法之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)和厚樸酚除具有抗氧化、抗炎、抗焦慮、抗菌、抗血栓形成作用外,還具有抗腫瘤的作用。本課題旨在研究和厚樸酚對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病急變期細(xì)胞株K562增殖、凋亡的影響。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)K562白血病細(xì)胞株:采用含10％熱滅活(56℃,30min)的小牛血清和青霉素(100U/ml)、鏈霉

2、素(100mg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基,在37℃、含5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng),3—4天換液傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.提取、培養(yǎng)健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞:分別取3位健康成人供血者的血液各50ml,按血液:淋巴細(xì)胞分離液3:1的比例把血標(biāo)本緩慢加入已裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,整個(gè)操作過(guò)程始終保持在冰浴中進(jìn)行。以2000g/min離心10min,收取單個(gè)核細(xì)胞層,洗滌3次后,以RPMI1640培養(yǎng)液

3、重懸細(xì)胞后常規(guī)培養(yǎng)。
　　 3.MTT法檢測(cè)藥物對(duì)K562細(xì)胞和健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖抑制作用:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞或健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞,以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組設(shè)立8個(gè)藥物濃度組,每組HNK的終濃度為5、10、15、20、25、30、35、40μg/ml,每個(gè)藥物濃度組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入同樣濃度的二甲基亞砜(DMSO),分別培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí),培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入20μl

4、 MTT溶液(5mg/ml),2500 rpm離心20min,棄上清,加入200μl DMSO,振蕩儀振蕩10min,充分溶解結(jié)晶物,酶標(biāo)儀測(cè)490nm處吸光度A值,計(jì)算增值抑制率。試驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 4.透射電鏡觀察K562細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化:調(diào)整K562細(xì)胞密度為1×106細(xì)胞/ml,與終濃度為10μg/ml的HNK共培養(yǎng)10h,并設(shè)對(duì)照組。之后分別收集細(xì)胞,1000 rpm離心10 min,PBS洗一遍,4％戊二醛固定過(guò)

5、夜,PBS沈3遍,1％鋨酸固定1 h,PBS充分清洗。梯度乙醇脫水,丙酮浸透、包埋、超薄切片,醋酸雙氧鈾-檸檬雙染,HITACHI1200ES型透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。
　　 5.用AnnexinV/Pl雙染細(xì)胞后用FCM法檢測(cè)K562細(xì)胞和健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡率變化:K562細(xì)胞和PBMCs分別在含有終濃度為0、10、15、20μg/ml HNK的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24和48小時(shí)。在各實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),收集各組

6、細(xì)胞,懸于binding buffer中,加入AnnexinV,避光室溫反應(yīng)15min,上機(jī)檢測(cè)前加入PI。
　　 6.Capase-3活性檢測(cè):按每孔1×106個(gè)細(xì)胞密度將K562細(xì)胞接種于6孔板,終濃度為10μg/ml的HNK處理6、12和24小時(shí)后,每個(gè)樣本收集約2×106個(gè)細(xì)胞,加入50μl預(yù)冷的cell lysis buffer重懸細(xì)胞,冰浴10min,離心10000g/min,轉(zhuǎn)移上清至新的Eppendorf管,置于

7、冰上。測(cè)蛋白濃度后,加入相應(yīng)cell lysis buffer稀釋蛋白至相同濃度,加30入50μl反應(yīng)液及5μl4mM DEVD-pNA,37℃孵育1小時(shí)后加入96孔板測(cè)OD405值,與對(duì)照組比較,計(jì)算增加倍數(shù)。
　　 7.檢測(cè)線(xiàn)粒體PT孔抑制劑CsA對(duì)細(xì)胞增殖的影響:分別取200μl密度為1×106個(gè)細(xì)胞/ml的K562細(xì)胞接種于96孔板,每孔加入終濃度為5μM的環(huán)孢菌素A(CsA),2小時(shí)后再加入終濃度為10μg/ml的和厚

8、樸酚處理K562細(xì)胞6h和12h；同時(shí)設(shè)立HNK單獨(dú)用藥組,終濃度為10μg/ml,作用同密度的K562細(xì)胞200l6h和12h,每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)。收集細(xì)胞,MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。
　　 8.熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase ChainReaction,RQ—PCR)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax mRNA的表達(dá):Trizol提取細(xì)胞總RNA、合成cDNA后使用特異性

9、引物擴(kuò)增靶基因,Bcl-2的擴(kuò)增條件:94℃變性45s,54℃退火45s,72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10min。Bax的擴(kuò)增條件:94℃變性45s,58℃退火45s,72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10min。β-actin的擴(kuò)增條件:94℃變性45s,58℃退火45s,72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物的進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.HNK抑制

10、K562細(xì)胞增殖
　　 結(jié)果顯示HNK對(duì)K562細(xì)胞24小時(shí)的IC50為17.3μg/ml,48小時(shí)的IC50為8.9μg/ml；HNK高濃度組(25μg/ml)對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均達(dá)90％,且抑制率隨HNK濃度的加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴(lài)性。而對(duì)正常外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯。
　　 2.電鏡觀察顯示HNK可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡
　　 經(jīng)10μg/ml的和厚樸酚作用10h

11、后,電鏡觀察K562細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)變化(包括細(xì)胞膜皺縮和起泡、染色質(zhì)凝聚、核碎裂和凋亡小體的形成)?？瞻讓?duì)照的K562細(xì)胞的電鏡下形態(tài),未見(jiàn)明顯凋亡形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.AnnexinV/PI方法證實(shí)HNK可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡
　　 分別用10、15、20μg/ml的HNK作用于K562和PBMCs,培養(yǎng)24和48小時(shí)后,與處理前相比,處理24小時(shí)后K562細(xì)胞組凋亡細(xì)胞所占比例隨著藥物濃度的增加而增加(分別為

12、10.5％±1.97、13.2％±3.12、28.7％±2.49),PBMCs組變化不明顯(分別為8.4％±1.71、9.4％±1.86、11.5％±1.92),同時(shí)也發(fā)現(xiàn),隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),K562細(xì)胞組的凋亡率增加(24h:10.5％±1.97、48h:29.2％±2.18),而PBMCs組變化不明顯(分別為8.4％±1.71、17.6％±1.46)。
　　 4.HNK處理K562細(xì)胞后Caspase-3活性增強(qiáng)

13、>　　 10μg/ml的HNK處理K562細(xì)胞6、12、24小時(shí)后,各時(shí)間組K562細(xì)胞中caspase-3活性與空白對(duì)照組的比值分別為:1.49±0.02,3.27±0.31,10.11±0.13。12和24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)HNK處理組K562細(xì)胞的Caspase-3活性與對(duì)照組相比有顯著增高(P<0.01)。
　　 5.線(xiàn)粒體PT孔抑制劑CsA能降低HNK對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用
　　 單獨(dú)用HNK或用線(xiàn)粒體PT孔抑

14、制劑環(huán)胞菌素A(終濃度為5μM)與終濃度為10μg/ml的HNK聯(lián)合處理K562細(xì)胞后,細(xì)胞增殖抑制率有所不同。HNK單獨(dú)作用6h、12h的細(xì)胞增殖抑制率分別為7.45±0.25％,30.25±1.20％。而CsA和HNK聯(lián)合作用6h、12h后,細(xì)胞增殖抑制率依次為2.14±0.41％和18.39±0.82％,較HNK單獨(dú)處理組明顯降低(P<0.05),同時(shí)5μM CsA對(duì)K562細(xì)胞基本無(wú)細(xì)胞毒作用。
　　 6.HNK影響K5

15、62細(xì)胞bcl-2和bax mRNA的表達(dá)
　　 與對(duì)照組相比,分別經(jīng)5、10和15μg/ml的HNK處理24小時(shí)后K562細(xì)胞內(nèi)Bax mRNA的表達(dá)量呈明顯的劑量依賴(lài)性上升趨勢(shì)(0.6832±0.0025,0.8504±0.0032,1.2161±0.0040,1.4023±0.0022)(P<0.01)。而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。各濃度組的Bcl-2與Bax表達(dá)量的比值呈下降趨勢(shì)(2.23