miR-181a抑制人紅白血病K562細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制的研究.pdf

1、微RNA是一類(lèi)由基因組編碼的長(zhǎng)約19-25個(gè)核苷酸的小分子、單鏈RNA，它們通常是由長(zhǎng)約60-100個(gè)核苷酸，并帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的微RNA前體剪切而來(lái)。近年來(lái)的研究已經(jīng)證明，微RNA通常是作為基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)控因子而發(fā)揮其功能，它們?cè)诟鞣N發(fā)育和生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。微RNA可以引起mRNA的降解(與靶基因mRNA完全互補(bǔ))或者抑制mRNA的翻譯(與靶基因mRNA不完全互補(bǔ))。然而，在動(dòng)物體內(nèi)，微RNA與mRNA的3′非編碼區(qū)序列發(fā)生不

2、完全互補(bǔ)，并通過(guò)一種未知的機(jī)制削弱蛋白質(zhì)的翻譯?，F(xiàn)在已知的微RNA，它們可以通過(guò)抑制翻譯但不影響靶基因mRNA的濃度，或者是直接誘導(dǎo)靶基因mRNA降解的方式，進(jìn)而抑制靶基因mRNA的表達(dá)。 迄今為止，在人類(lèi)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量微RNA，而其中一些微RNA在造血過(guò)程和造血系統(tǒng)疾病發(fā)生過(guò)程中起了一定的作用?，F(xiàn)有的一些資料提示，人類(lèi)白血病的發(fā)生可能與微RNA有關(guān)。miR-181a是小鼠骨髓細(xì)胞中特異表達(dá)的一類(lèi)微RNA，當(dāng)它在造血干細(xì)胞或祖

3、細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)B細(xì)胞的分化。已有研究證實(shí)，通過(guò)反義抑制肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，提示miR-181a可能與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。與未經(jīng)誘導(dǎo)的人白血病HL-60細(xì)胞相比，佛波酯誘導(dǎo)下向單核或巨噬樣細(xì)胞分化的HL-60細(xì)胞內(nèi)，miR-181a的表達(dá)發(fā)生下調(diào)，提示miR-181a可能與白血病發(fā)生密切相關(guān)，但其具體的作用機(jī)制仍不清楚。綜上所述，這些結(jié)果提示miR-181a可能是一個(gè)與造血調(diào)控及血液

4、系統(tǒng)疾病發(fā)生相關(guān)的重要調(diào)控因素。 為進(jìn)一步闡明miR-181a的作用機(jī)制，探討其對(duì)于白血病細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)錄水平的影響，我們將化學(xué)合成的miR-181aduplex轉(zhuǎn)染進(jìn)入人白血病K562細(xì)胞，并采用寡核苷酸芯片技術(shù)從全基因組水平上研究了K562細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。 首先，基于siRNAduplex在形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)過(guò)程中的不對(duì)稱(chēng)性的特點(diǎn)，我們初

5、步設(shè)計(jì)了針對(duì)實(shí)驗(yàn)研究所需的miR-181aRNAduplex。采用生物學(xué)軟件Oligo6.0評(píng)價(jià)其熱動(dòng)力學(xué)特性，并通過(guò)改變反義鏈3'端個(gè)別堿基序列使其滿(mǎn)足熱動(dòng)力學(xué)的需求，從而確定最終的設(shè)計(jì)序列。結(jié)果顯示，利用RISC形成過(guò)程的不對(duì)稱(chēng)性，結(jié)合生物學(xué)軟件Oligo6.0的熱動(dòng)力學(xué)分析來(lái)設(shè)計(jì)miRNARNAduplex，是一種簡(jiǎn)便可行、有效的方法。 其次，我們利用Oligofectamine脂質(zhì)體法將化學(xué)合成的miR-181adupl

6、ex轉(zhuǎn)染人紅白血病K562細(xì)胞，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)其對(duì)K562生長(zhǎng)抑制的作用。MTT法檢測(cè)24，48，72h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(30.67±6.24)％，(47.95±3.55)％，(51.56±4.11)％；而臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(29.71±2.68)％，(49.21±5.14)％，(55.31±4.29)％。結(jié)果采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩種方法計(jì)算的細(xì)胞

7、生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著性差異(P=0.515)；MTT法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法在24h測(cè)得的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與48、72h相比，差異均有顯著性(P＜0.01)，而48h與72h相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。瑞氏-吉姆薩染色顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制的變化。上述證據(jù)表明，轉(zhuǎn)染miR-181a進(jìn)入K562細(xì)胞會(huì)抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)。 最后，我們應(yīng)用基因芯片技術(shù)及系統(tǒng)分析的方法來(lái)研究微RNA對(duì)人白血病K562細(xì)胞基因表達(dá)

8、譜的影響，以闡明miR-181a可能的調(diào)控機(jī)制。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)采用Oligofectamine脂質(zhì)體法。轉(zhuǎn)染后48h，應(yīng)用AgilentHuman1A寡核苷酸基因芯片檢測(cè)和分析對(duì)照組與微RNA轉(zhuǎn)染組K562細(xì)胞間的基因表達(dá)譜差異。從20000個(gè)左右的候選基因中，篩選出228個(gè)差異表達(dá)基因。與對(duì)照組K562細(xì)胞比較，表達(dá)下調(diào)的有169個(gè)，主要有原癌基因、DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄因子、代謝相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、細(xì)胞周期及發(fā)育相關(guān)基因等；表達(dá)上調(diào)的基

9、因有59個(gè)，主要有抑癌基因、代謝相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、免疫防御相關(guān)基因等。半定量RT-PCR驗(yàn)證了CTCF、ZAP70、VAMP1、CNOT4、SEMA4C和RALA6個(gè)基因表達(dá)的變化。可見(jiàn)，微RNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后，通過(guò)抑制其靶基因的表達(dá)，進(jìn)而引起了細(xì)胞內(nèi)一系列基因的表達(dá)變化。這些基因可能與微RNA的功能相關(guān)，同時(shí)也是其在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制基因表達(dá)的調(diào)控方式實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。這為進(jìn)一步深入研究微RNA的功能及其具體的作用機(jī)制提供了重要

10、的線(xiàn)索和依據(jù)。 綜上所述，我們采用寡核苷酸芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一系列受miR-181a表達(dá)調(diào)控的基因。差異基因的改變中包括了原癌基因的表達(dá)下調(diào)和抑癌基因的表達(dá)上調(diào)，這可能在腫瘤發(fā)生及其分子水平的改變中具有重要的作用。原癌基因的激活和抑癌基因的損傷是腫瘤破壞正常細(xì)胞周期的兩種方式。因此，我們猜想這些基因的異常改變使得K562細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了抑制。此外，本研究也為脊椎動(dòng)物微RNA具有多個(gè)靶基因，涉及基因調(diào)控的多個(gè)方面的假說(shuō)提供了重要的實(shí)驗(yàn)