抗微管藥物土貝母苷甲介導(dǎo)的人紅白血病細(xì)胞K562凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.pdf

1、背景與目的: 微管（microtubule）是存在于所有真核細(xì)胞中由微管蛋白（tubulin）和微管相關(guān)蛋白（microtubule-associated proteins, MAPs）組裝成的長管狀細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，通過微管蛋白亞單位的組裝和去組裝能改變其長度，對低溫、高壓、秋水仙堿和紫杉醇等敏感，是細(xì)胞骨架的主要結(jié)構(gòu)成分之一。在細(xì)胞內(nèi)微管是紡錘體、基粒、中心粒、鞭毛的基本結(jié)構(gòu)成分。在細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持、細(xì)胞分裂和運(yùn)動中微管都起著重要作用。

2、 近年來微管已成為抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)，紫杉醇、秋水仙堿等藥物就是具有顯著抗微管活性的物質(zhì)。其抗腫瘤機(jī)制包括： 1. 結(jié)合微管蛋白，抑制其裝配與去裝配的動態(tài)平衡而干擾微管的功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂中止，抑制細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。 2. 通過改變MAPK以及cylinB/P34cdc2等激酶的活性而改變其底物－微管相關(guān)蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而干擾細(xì)胞的微管系統(tǒng)，使細(xì)胞阻滯于有絲分裂期。 3. 作用于多

3、個誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白激酶信號通路：激活Raf-1,使Bcl-2磷酸化，從而誘導(dǎo)凋亡；作用于MAPK,使MAPK活性改變，磷酸化Bcl-2而使細(xì)胞凋亡；作用于P34cdc2,通過磷酸化Bcl-2參與細(xì)胞凋亡。 土貝母，[Bolbostemma paniculatum（Maxim.）Franquet (Cucurbitaceae)]是一種傳統(tǒng)中藥，載于清代趙學(xué)敏編著的《本草綱目拾遺》。古代用它的塊莖來治療乳巖、乳癰、乳腺增生和瘰疬等

4、疾患。四川省和陜西省的老中醫(yī)用它來治療食道癌和胃癌，效果顯著，但因惡心、嘔吐等消化道副作用而限制了它的臨床應(yīng)用。我們從1978年開始從生藥土貝母中分離、純化抗癌活性成分，并對其中得率最高（1.9％）、水溶性和穩(wěn)定性較好的土貝母苷甲（下稱苷甲）的藥效學(xué)、藥代動力學(xué)、毒理學(xué)及其作用機(jī)制進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。 我室采用加溫聚合—低溫解聚兩次循環(huán)法從新鮮豬腦中提取微管蛋白，經(jīng)純度鑒定及定量后作為微管蛋白的樣品。用比濁法和離心沉降實(shí)驗(yàn)證明苷

5、甲可抑制提取的豬腦微管蛋白聚合，其作用類似于秋水仙堿（本室待發(fā)表文章）。 本文試圖進(jìn)一步研究苷甲在K562細(xì)胞內(nèi)對微管的作用，并探討其通過干擾微管系統(tǒng)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。 方法: 1. MTT法檢測苷甲對K562細(xì)胞生長的影響。 2. 采用形態(tài)學(xué)方法（光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡）檢查在苷甲作用下K562細(xì)胞形態(tài)的變化。 3. 用流式細(xì)胞術(shù)觀察和分析在苷甲作用下K562細(xì)胞凋亡及

6、周期變化的情況。 4. 細(xì)胞免疫熒光法從形態(tài)學(xué)上觀察苷甲對微管蛋白表達(dá)及分布的影響。 5. 采用改進(jìn)的Minotti法提取人紅白血病細(xì)胞K562內(nèi)聚合的和解聚的微管蛋白，并用蛋白免疫印跡法來檢測苷甲對微管蛋白解聚－聚合的影響。 6. 采用蛋白免疫印跡法檢測與微管相關(guān)蛋白有關(guān)的和與抗微管藥物介導(dǎo)凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)的蛋白激酶Bcl-2、Raf-1、和P34cdc2的表達(dá)以及ERK1/2的活性。 結(jié)果：

7、 1. 苷甲明顯抑制K562細(xì)胞的生長，且呈時間劑量依賴關(guān)系。苷甲作用K562細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為19.7、18.5、15.9μmol·L-1。 2. 苷甲誘導(dǎo)K562細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征：培養(yǎng)的K562細(xì)胞經(jīng)20μmol·L-1苷甲處理24h后，倒置顯微鏡下可看到細(xì)胞體積變大，胞膜出泡。細(xì)胞涂片瑞氏-吉姆薩染色可見較多細(xì)胞染色質(zhì)濃聚成團(tuán)塊狀，核碎裂。經(jīng)hoechst33342-PI或AO-

8、EB染色，在熒光顯微鏡下可觀察到經(jīng)苷甲作用的K562細(xì)胞皺縮，變形，染色質(zhì)濃縮，部分核染色體碎裂。 3. 20μmol·L-1苷甲作用K562細(xì)胞6h，流式細(xì)胞儀即檢出亞倍體峰，G2/M期細(xì)胞增多。隨著作用時間延長，細(xì)胞被阻滯于G2/M期更加明顯，細(xì)胞的凋亡率也增加。 4. 20μmol·L-1苷甲能明顯抑制K562細(xì)胞內(nèi)微管蛋白聚合。 5. 20μmol·L-1苷甲能使K562細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)降低，并出現(xiàn)

9、磷酸化。苷甲能激活ERK1/2并使c-Raf-1和P34cdc2的表達(dá)升高。 結(jié)論： 1. 苷甲明顯抑制K562細(xì)胞的生長，其效果與時間和濃度相關(guān)。 2. 苷甲能把K562細(xì)胞阻滯在G2/M期并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。 3. 苷甲在細(xì)胞內(nèi)能明顯抑制微管蛋白聚合，證實(shí)其為一種抗微管藥物。 4. 苷甲可能通過以下機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡：抑制微管蛋白聚合進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)凋亡；通過激活ERK及P