土貝母皂苷、苷甲的抗癌作用研究.pdf

1、本文以中藥材土貝母為原料，采用溶劑法——柱層析法從中分離純化得到抗癌活性成分土貝母皂苷(皂苷)和土貝母苷甲(苷甲)，并重點(diǎn)研究了皂苷、苷甲的抗微管作用及對(duì)人低分化上皮樣鼻咽癌細(xì)胞(CNE-2Z)凋亡的影響。　　1.采用AKTATMexplorer100快速純化工藝開拓系統(tǒng)，在實(shí)驗(yàn)條件下快速分離得到皂苷和苷甲，為土貝母皂苷成分分離提取工藝的簡(jiǎn)化作了有益的探索?！　?.本文較系統(tǒng)研究了苷甲的抗微管作用，研究認(rèn)為5μmol/L苷甲即可抑制

2、離體條件下豬腦微管蛋白加熱聚合，當(dāng)其濃度在5～10μmol/L時(shí)，苷甲對(duì)微管蛋白聚合的抑制作用與苷甲的濃度呈正相關(guān)?！　?.采用細(xì)胞免疫熒光法研究皂苷、苷甲對(duì)CNE-2Z細(xì)胞微管網(wǎng)絡(luò)的影響。25μmol/L的皂苷、苷甲作用CNE-2Z細(xì)胞3h后，熒光圖像顯示其結(jié)果與2.5μmol/L秋水仙堿作用細(xì)胞3h的結(jié)果相似，熒光充滿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，正常細(xì)胞所具有的毛玻璃樣微管網(wǎng)絡(luò)消失，表明皂苷、苷甲引起細(xì)胞微管解聚，2.5μmol/L紫杉醇處理

3、細(xì)胞3h后，細(xì)胞內(nèi)熒光主要呈束狀或晶核樣，提示微管蛋白聚合?！　?.采用透射電鏡觀察皂苷、苷甲對(duì)CNE-2Z細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。正常培養(yǎng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，微管清晰可見；25μmol/L的皂苷、苷甲作用24h后，多數(shù)細(xì)胞均不同程度受損，細(xì)胞的微絨毛減少乃至消失；微管網(wǎng)絡(luò)消失；細(xì)胞變圓；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)彎曲、折疊；線粒體受損，表現(xiàn)為線粒體腫脹或皺縮，數(shù)量減少；胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量自噬泡；細(xì)胞核界限不完整，核固縮或碎裂；細(xì)胞質(zhì)溶解，呈現(xiàn)典型的凋亡或壞死特征。

4、50μmol/L皂苷作用24h，則大多細(xì)胞壞死。　　5.蛋白免疫印跡結(jié)果證實(shí)10μmol/L皂苷、苷甲作用CNE-2Z細(xì)胞24h，細(xì)胞內(nèi)聚合的微管蛋白減少，解聚的微管蛋白相應(yīng)增加。25μmol/L皂苷、苷甲分別作用細(xì)胞1h，6h，12h和24h，細(xì)胞內(nèi)解聚的微管蛋白比例呈時(shí)間依賴上升?！　?.通過(guò)分子生物學(xué)方法進(jìn)一步證實(shí)皂苷、苷甲誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡。試驗(yàn)條件下皂苷及苷甲均使細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Raf-1蛋白磷酸化活化。

5、隨著藥物作用濃度升高，時(shí)間延長(zhǎng)，Bax及磷酸化Raf-1蛋白表達(dá)增多。Raf-1蛋白因?yàn)榱姿峄罨?，啟?dòng)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2和Bax分別抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。　　7.采用血清饑餓法對(duì)CNE-2Z細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)單的周期同步化處理后，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定25μmol/L皂苷、苷甲作用24h后各時(shí)相的CNE-2Z細(xì)胞分布情況，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)條件下皂苷、苷甲對(duì)CNE-2Z細(xì)胞周期影響不大?！　”狙芯康奶厣蛣?chuàng)新之處：　　1.利用制備型液相色譜簡(jiǎn)單

6、快速地分離到到土貝母中皂苷、苷甲有效成分。土貝母直接入藥時(shí)有效成分不明確，劑量不確定，毒副作用大。苷甲的抗腫瘤作用強(qiáng)，毒副作用小，且得率高(1.9％)，水溶性和穩(wěn)定性都較好。從增加得率，簡(jiǎn)化工藝和降低成本的角度考慮，皂苷和苷甲應(yīng)該首先開發(fā)利用?！　?.在我國(guó)，鼻咽癌是嚴(yán)重威脅人們健康的十大惡性腫瘤之一。臨床上鼻咽癌以放療為首選，目前尚無(wú)低毒高效的化療藥物。皂苷及苷甲對(duì)人低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

7、，且前期的研究工作已證實(shí)皂苷、苷甲達(dá)到有效劑量時(shí)對(duì)人體無(wú)明顯毒副作用，皂苷、苷甲是具有潛力的鼻咽癌化療藥物。這是本文研究中最重要的創(chuàng)新之處。　　3.腫瘤細(xì)胞失去了正常細(xì)胞的控制機(jī)制，癌組織中的細(xì)胞更傾向處于分裂期，而微管轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N體是細(xì)胞分裂中的一個(gè)重要事件。正常細(xì)胞的骨架完整，修復(fù)快，藥物不易對(duì)其造成損傷。腫瘤細(xì)胞骨架不完整，組裝程度差，藥物作用后不能及時(shí)有效地修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖被抑制，因而近年來(lái)，抗微管藥物的研究開發(fā)倍受矚目。本研