β-catenin在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達(dá)及其特異的shRNA干擾對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的初步研究.pdf

1、本文采用普通RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn)在慢粒急變期β-catenin表達(dá)明顯增高，采用實(shí)時(shí)定量PCR及western blot方法研究了β-catenin在慢粒各期的表達(dá)情況，然后以K562細(xì)胞為研究對(duì)象，用RNAi的方法，研究降低β-catenin表達(dá)后對(duì)細(xì)胞的影響。全文分為以下兩部分： 一、β-catenin在慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)的研究 采用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)定量.PCR的方法定量檢測(cè)β-catenin在慢

2、粒各期中的表達(dá)情況，并同時(shí)檢測(cè)BCR/ABL和c-myc的表達(dá)變化，為進(jìn)一步探討β-catenin在慢粒急變中的意義提供依據(jù)。同時(shí)采用western blot的方法檢測(cè)慢粒慢性期與急變期β-catenin蛋白水平的表達(dá)。 1.首先應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法分別檢測(cè)了β-catenin在48例慢性粒細(xì)胞白血病(慢性期34例，加速期4例，急變期10例)及9例正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin在正

3、常人及慢粒各期均有一定程度的表達(dá)，其中，慢粒急變期β-catenin的表達(dá)比慢性期(p<0.001)、加速期(p=0.016)和正常供者均明顯升高(p=0.004)，而加速期、慢性期、正常人之間則無(wú)差異。β-catenin表達(dá)量與患者年齡、性別、外周血白細(xì)胞數(shù)及骨髓原始細(xì)胞比例均未見相關(guān)性。 2.對(duì)19例慢粒慢性期和6例急變期的標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)了BCR/ABL的表達(dá)水平，結(jié)果顯示BCR/ABL在慢粒急變期表達(dá)水平明顯升高(成組設(shè)計(jì)t

4、檢驗(yàn)，p<0.001)，且相關(guān)性分析表明：β-catenin與BCR/ABL的表達(dá)有相關(guān)性(r=0.620，p<0.001)。 3.在25例慢?；颊咧袡z測(cè)了c-myc的表達(dá)，顯示該基因在慢粒標(biāo)本中普遍存在表達(dá)，但與β-catenin和BCR/ABL的表達(dá)量之間無(wú)相關(guān)性，在CML慢性期和急變期，其表達(dá)量也未見差別(p=0.57)。 4.β-catenin蛋白水平的檢測(cè)顯示4例急變期慢粒中，3例為強(qiáng)陽(yáng)性，1例中等陽(yáng)性，而13

5、例慢性期中9例陽(yáng)性，其中3例中等陽(yáng)性，6例弱陽(yáng)性，與mRNA檢測(cè)結(jié)果基本一致。 二、β-catenin特異的shRNA干擾對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的初步研究 以K562細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建含有有效干擾片斷并可在細(xì)胞內(nèi)形成shRNA的質(zhì)粒，將干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR和westernblot檢測(cè)β-catenin表達(dá)水平變化，集落培養(yǎng)觀察集落形成能力的差別。 1.干擾質(zhì)?？捎行Ы档挺?cate

6、nin mRNA水平的表達(dá)，短期培養(yǎng)對(duì)蛋白水平的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)明顯影響。經(jīng)篩選后長(zhǎng)期培養(yǎng)，對(duì)照組可篩選到GFP陽(yáng)性的細(xì)胞，而干擾組由于β-catenin的下調(diào)無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞長(zhǎng)期存活和生長(zhǎng)。 2.集落培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞無(wú)論集落形成率還是形成集落的大小均明顯低于對(duì)照質(zhì)粒組。 結(jié)論：本研究顯示，β-catenin在慢粒急變期表達(dá)明顯增高，并與BCR/ABL表達(dá)升高相關(guān)，可能參與慢粒急變，是慢粒急變的機(jī)制之一。以β-cateilin為靶