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文檔簡介
1、目的:研究生長抑制特異蛋白GAS2在慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)細(xì)胞中的表達(dá)與功能,并初步探討其作用機制。
方法:(1)使用密度梯度離心獲取CML患者和健康供體骨髓中的單個核細(xì)胞,使用CD34細(xì)胞磁珠富集試劑盒純化CD34+細(xì)胞,并使用FACS純化lin-CD34+和lin-CD34+CD38-細(xì)胞。Q-RT-PCR方法檢測各類細(xì)胞中的GAS2轉(zhuǎn)錄本表達(dá),免疫熒光的方法檢測CD3
2、4+細(xì)胞中GAS2蛋白的表達(dá)。
(2)制備攜帶靶向GAS2的shRNA的慢病毒,并侵染CML細(xì)胞株(K562和MEG-01)以及患者的CD34+細(xì)胞,檢測GAS2沉默與對照細(xì)胞的Calpain活性、生長和集落生成能力。
(3)使用PCR的方式擴增GAS2DN(GAS2△171-313,GAS2的顯性負(fù)性突變體),并克隆至慢病毒載體中。在CML細(xì)胞株(K562和MEG-01)以及患者的CD34+細(xì)胞中過表達(dá)GAS2DN
3、,而后檢測GAS2DN與對照細(xì)胞的Calpain活性、生長及集落生成能力。
(4)使用伊馬替尼(Imatinib mesylate,IM)敏感的K562細(xì)胞研究GAS2沉默和GAS2DN表達(dá)對細(xì)胞IM敏感性的影響。
(5)使用MEG-01細(xì)胞研究GAS2DN對細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力的影響。
(6)使用免疫共沉淀研究GAS2與Calpain2在白血病細(xì)胞中是否存在相互結(jié)合。在GAS2DN過表達(dá)的細(xì)胞中利用RNA
4、i抑制Calpain2的表達(dá),以研究Calpain2活性的變化在GAS2DN影響CML細(xì)胞生長中的作用。
(7)使用TOPFlash/FOPFlash報告基因質(zhì)粒研究GAS2沉默及GAS2DN對CML細(xì)胞中β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的影響;也使用免疫印跡等方法研究GAS2沉默及GAS2DN對CML細(xì)胞中β-catenin表達(dá)和定位的影響。
(8)建立GAS2DN表達(dá)及對照MEG-01細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù),并通過與公共
5、數(shù)據(jù)庫中CML相關(guān)數(shù)據(jù)的對比研究靶向GAS2影響CML細(xì)胞生長的分子機制。
(9)使用Q-RT-PCR和免疫印跡等方法驗證響應(yīng)GAS2DN表達(dá)的候選基因,并使用基因沉默的方式研究候選基因HNRPDL在CML細(xì)胞生長的功能。
結(jié)果:GAS2的mRNA表達(dá)在CML來源的細(xì)胞中均較健康供體來源細(xì)胞顯著增高;免疫熒光顯示GAS2蛋白在患者CD34+細(xì)胞中的表達(dá)也較正常對照細(xì)胞增高。使用兩條獨立的shRNA序列能有效抑制CML
6、細(xì)胞中的GAS2表達(dá),并導(dǎo)致GAS2蛋白表達(dá)的降低并活化細(xì)胞中的Calpain。GAS2沉默使CML細(xì)胞株(K562和MEG-01)和患者CD34+細(xì)胞的生長及集落生成能力顯著降低。我們成功克隆了GAS2DN(GAS2△171-313,GAS2的顯性負(fù)性突變體),并使用慢病毒遞送至CML細(xì)胞中。這導(dǎo)致細(xì)胞中Calpain活性的增高并使它們的生長及集落生成能力顯著降低。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)GAS2DN抑制CML患者CD34+細(xì)胞集落生成的能
7、力顯著強于它對健康供體來源CD34+細(xì)胞的抑制。GAS2沉默和表達(dá)GAS2DN都能增強K562細(xì)胞的IM敏感性。GAS2DN也顯著抑制了MEG-01細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤的能力(對照組:10/12,約83%;GAS2DN組:3/10,30%);且減緩腫瘤細(xì)胞的生長速度。
免疫共沉淀表明GAS2與Calpain2在白血病細(xì)胞中相互結(jié)合。使用Calpain2的RNAi能顯著“挽救”GAS2DN所導(dǎo)致的CML細(xì)胞生長抑制。我們發(fā)現(xiàn)K56
8、2和MEG-01細(xì)胞不具有β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性,靶向GAS2不影響β-catenin的表達(dá)及定位。
為研究靶向GAS2抑制CML細(xì)胞生長的分子機制,我們建立了表達(dá)GAS2DN和對照MEG-01細(xì)胞的基因表達(dá)譜。通過與公共數(shù)據(jù)庫中相關(guān)數(shù)據(jù)的對比及表達(dá)驗證,我們發(fā)現(xiàn)GAS2DN能顯著抑制HNRPDL、PTK7和UCHL5的表達(dá),而這3個基因在CML的單個核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞中的表達(dá)均較正常對照細(xì)胞顯著升高。在K562細(xì)胞
9、中沉默HNRPDL能顯著抑制細(xì)胞的生長及集落生成能力,并增強其IM敏感性。
結(jié)論:CML與健康供體骨髓細(xì)胞相比,GAS2的轉(zhuǎn)錄本和蛋白表達(dá)均顯著升高。沉默GAS2或者表達(dá)GAS2DN能顯著抑制CML細(xì)胞的體外生長、集落生成能力和裸鼠皮下成瘤能力。此外,GAS2DN抑制患者CD34+細(xì)胞的能力強于它抑制正常骨髓CD34+細(xì)胞的能力,表明該抑制作用具有一定的特異性。最后,靶向GAS2增強CML細(xì)胞的IM敏感性。靶向GAS2的生長抑
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