P2X家族受體在白血病中的異常表達(dá)及異常功能研究.pdf

1、核苷酸類(lèi)物質(zhì)是新近闡明的細(xì)胞間通訊載體，它們結(jié)合細(xì)胞膜上的P2家族嘌呤受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存和功能。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同P2家族受體可分為P2X和P2Y兩個(gè)家族，P2Y為七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，而P2X家族受體是一種ATP門(mén)控的離子通道，具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及位于胞內(nèi)的氨基和羧基末端。P2X受體與配體結(jié)合后構(gòu)象改變，實(shí)現(xiàn)通道開(kāi)啟、關(guān)閉和離子的通透。P2X7受體是P2X家族特殊成員之一，其羧基末端最長(zhǎng)，與其他P2X家族受體亞型在藥理學(xué)性質(zhì)和形成溶

2、胞孔方面有明顯區(qū)別。它對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子有較強(qiáng)的選擇性，在激動(dòng)劑ATP或BzATP刺激時(shí)離子通道選擇性地開(kāi)放，對(duì)Na+、K+和Ca2+選擇性通透；重復(fù)或者延長(zhǎng)刺激，該通道形成大孔，可使熒光黃、溴化乙錠和YO-PRO等大分子通過(guò)。
　　 P2X受體廣泛分布于各個(gè)組織和細(xì)胞，功能呈多樣性，參與各種生理和病理過(guò)程。且越來(lái)越多的證據(jù)表明P2X受體各亞型之間的共表達(dá)共組裝會(huì)形成新的功能性通道而發(fā)揮獨(dú)特的功能，這需要我們更全面的研究P2X受體家族

3、在任何一種細(xì)胞型或任何生理病理過(guò)程中的表達(dá)狀態(tài)，利于更深入闡明他們所發(fā)揮的功能。P2X受體在血液系統(tǒng)腫瘤中的意義越來(lái)越受到關(guān)注，目前多集中于P2X7受體亞型的研究，發(fā)現(xiàn)P2X7受體表達(dá)異常與C-LL，AML，ALL，MDS，CML等多種白血病有關(guān)，目前還沒(méi)有系統(tǒng)而全面的報(bào)道研究P2X受體家族在兒童急性白血病中的表達(dá)特點(diǎn)。P2X7的功能受多因素、多環(huán)節(jié)的調(diào)控，隨著對(duì)P2X7受體研究的逐漸深入，研究者不斷發(fā)現(xiàn)各種功能異常的P2X7受體。我們

4、在白血病細(xì)胞系LCL-H和J6-1中發(fā)現(xiàn)了P2X7受體功能的異常，高表達(dá)CD39相關(guān)的ATP酶活性是LCL-H細(xì)胞P2X7受體功能異常的原因，而J6-1細(xì)胞中有其他因素影響P2X7受體的功能。我們從J6-1中克隆得到的P2X7受體基因在第559位有一個(gè)A-G有義突變，導(dǎo)致hsn187-Asp187（N187D），我們?cè)噲D從基因水平解釋該突變體功能異常的原因。
　　 根據(jù)以上的國(guó)內(nèi)外研究背景及我室以往的研究結(jié)果，本文以P2X受體家

5、族在兒童急性白血病的表達(dá)特點(diǎn)及J6-1細(xì)胞系來(lái)源的突變型P2X7受體（N187D）功能異常為研究重點(diǎn)，深入探討P2X受體家族與白血病的關(guān)系及突變型P2X7受體功能調(diào)控的影響及其在白血病中的意義。本文主要完成了以下研究工作：
　　 1.應(yīng)用realtimeRT-PCR、westernblot和熒光測(cè)鈣方法，證明了P2X1，4，5，7受體亞型在兒童急性白血病患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中廣泛表達(dá)，且其mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照。其

6、中尤為關(guān)注的是相對(duì)于初診患者，P2X7受體顯著高表達(dá)于復(fù)發(fā)患者中。線(xiàn)性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)P2X受體亞型之間存在顯著的共表達(dá)特征，尤其是P2X4和P2X7之間的共表達(dá)。另外，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化療達(dá)到完全緩解后，除P2X1受體略有降低外P2X4，5，7受體表達(dá)水平均顯著降低。提示造血相關(guān)的P2X受體與兒童急性白血病的發(fā)生、發(fā)展和治療密切相關(guān)。
　　 2.在該突變體（N187D）序列基礎(chǔ)上用overlapPCR方法回復(fù)突變得到野生型P2X7，構(gòu)建了

7、野生型及突變型P2X7真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染不表達(dá)P2X7受體的K562細(xì)胞，RT-PCR、Westernblot和免疫熒光法證實(shí)構(gòu)建成功，獲得了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株（K562-W/K562-M）；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變型P2X7受體對(duì)激動(dòng)劑刺激敏感性降低，在常規(guī)濃度激動(dòng)劑BzATP刺激下不能引發(fā)受體介導(dǎo)的一系列反應(yīng)，而在高濃度的激動(dòng)劑刺激下增加細(xì)胞凋亡率，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，引起ERK磷酸化水平升高，并且該突變型P2X7受體敏感性降低與細(xì)胞表面ATPa

8、se活性無(wú)關(guān)；相對(duì)于K562-W，K562-M細(xì)胞在體外及裸鼠體內(nèi)增殖能力明顯增強(qiáng)，凋亡減少，且共聚焦顯微鏡下顯示K562-M瘤塊中有大量的CD206陽(yáng)性的Ⅱ型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和明顯的血管新生，實(shí)時(shí)定量PCR方法證明K562-M瘤組織中人源和鼠源性促血管新生因子VEGF和人源的單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）表達(dá)水平升高，提示血管新生和巨噬細(xì)胞在其中發(fā)揮重要的作用。上述結(jié)果提示除了減少的細(xì)胞凋亡因素外，突變型P2X7受體N187D在體內(nèi)還

9、通過(guò)其他復(fù)雜的機(jī)制促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展。
　　 綜上所述，本文首次系統(tǒng)而全面的研究了P2X受體家族在兒童急性白血病中的表達(dá)特點(diǎn)及其與疾病治療的關(guān)系，首次在血液疾病中發(fā)現(xiàn)了P2X受體亞型之間顯著的共表達(dá)特點(diǎn)，為深入闡明P2X受體家族介導(dǎo)的信號(hào)傳遞在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)；首次確定了一種配體敏感性降低的新P2X7突變類(lèi)型，區(qū)別于以往報(bào)道的無(wú)功能型和功能增強(qiáng)型P2X7突變體，該突變體功能異常與惡性腫瘤發(fā)展相關(guān)，為進(jìn)一步闡明