髓系白血病異常NHEJ DNA修復功能的研究.pdf

1、目的：設計并建立一個用于臨床標本的體外NHEJ檢測體系，以正常骨髓或外周血作對照，研究髓系白血病細胞非同源末端連接修復DNA雙鏈斷裂的能力和DNA斷端連接的精確性。研究髓系白血病過度活躍的修復能力是否依賴NHEJ相關的主要蛋白質功能，以及髓系白血病細胞Ku蛋白和DNA依賴蛋白激酶的表達水平和基因表達情況。　　方法：正常骨髓或外周血單個核細胞、白血病細胞提取的核蛋白與線性的pUC18質粒DNA在體外一定的條件下一起進行連接反應。結束后質

2、粒DNA經凝膠分離，用SYBRgreenⅠ染色成像。每個標本的DNA末端連接能力以所連接的DNA片段的輝度除以所有DNA片段的輝度的百分比表示。以上述方法對7種髓系白血病細胞株、淋巴系白血病細胞株Jurkat、骨髓瘤細胞株U266、5種膠質瘤細胞株、16例正常骨髓或外周血單個核細胞、20例慢性粒細胞白血病細胞和19例初診的急性髓系白血病細胞進行檢測。正常骨髓單個核細胞，初診的慢性粒細胞白血病細胞，與K562進行Co60輻照6Gy，培養(yǎng)1

3、2～16小時，進行連接實驗，同時取照射后即時收集的細胞和自身對照作對比。慢粒白血病細胞用10μmol/L三氧化二砷作用24小時后檢測DNA連接能力。感受態(tài)大腸桿菌DH5α與正常骨髓和白血病細胞連接的質粒DNA一起電擊轉化，培養(yǎng)于含X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基瓊脂板表面，質粒完整修復的菌落呈藍色。若修復不準確菌落呈白色。錯誤修復率用白斑占所有形成的菌落克隆的百分比表示。設計圍繞EcoRⅠ酶切位點的引物，對所有白斑和部分藍斑進行PCR分