Annexin A1在急性髓系白血病細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、白血病是一類造血干細(xì)胞異常增殖的惡性血液腫瘤，分為急性髓系白血病，急性淋巴系白血病，慢性髓系白血病，慢性淋巴系白血病。在年齡為0-14歲的孩童中，白血病是最常被診斷出的癌癥類型，其人數(shù)占各類癌癥總?cè)藬?shù)的35％，且白血病的發(fā)病率逐年呈上升趨勢(shì)。目前，大部分急性髓系白血病不能得到很好的控制，存在治療藥物種類少、靶向性差、不能完全達(dá)到預(yù)期治療效果等問題。因此，尋找并開發(fā)更為有效的白血病治療藥物、降低藥物毒副作用、提高治愈率始終是白血病研究領(lǐng)域

2、亟待解決的科學(xué)問題。Annexin A1是一種膜聯(lián)蛋白，參與了體內(nèi)多種病理生理過程。前期研究報(bào)道Annexin A1在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但目前未見AnnexinA1在髓系白血病中的相關(guān)研究報(bào)道。本論文將收集急性髓系白血病患者外周血樣和正常志愿者外周血樣，采用Western blot方法檢測(cè)AnnexinA1在白血病患者外周血中的表達(dá)水平;通過構(gòu)建Annexin A1敲降表達(dá)的急性髓系白血病細(xì)胞模型（選用

3、KG-1a和HL60兩種細(xì)胞系），在細(xì)胞和分子水平明確Annexin A1在急性髓系白血病增殖中的功能，并初步闡明其分子機(jī)制;采用已構(gòu)建好的Annexin A1敲降表達(dá)的急性髓系白血病細(xì)胞模型以及親本細(xì)胞構(gòu)建荷瘤裸鼠模型，在動(dòng)物水平對(duì)Annexin A1的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　本研究收集了2014年至2017年期間在浙江省人民醫(yī)院接受住院治療的37例白血病初治患者外周血作為研究對(duì)象，通過紅細(xì)胞裂解方法提取白細(xì)胞，然后蛋白樣品

4、進(jìn)行SDS-PAGE電泳后進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，與正常人相比，白血病患者外周血白細(xì)胞中Annexin A1蛋白表達(dá)量顯著高于正常人。在Annexin A1敲降表達(dá)的KG-1a和HL60細(xì)胞模型中，研究結(jié)果顯示Annexin A1基因被干擾后，KG-1a和HL60細(xì)胞中的Annexin A1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，與親本和對(duì)應(yīng)的空載細(xì)胞相比，KG-1a-shAnnexin A1和HL60-shAnnexinA1增殖速率明顯降低，倍增時(shí)

5、間明顯變長(zhǎng)，表明AnnexinA1蛋白有促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞增殖的功能。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，Annexin A1敲降表達(dá)后促使KG-1a細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，AnnexinA1表達(dá)受干擾后不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示，急性髓系白血病細(xì)胞KG-1a中的Annexin A1表達(dá)敲降表達(dá)后，Notch信號(hào)通路中的Notch1和p15蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。通過進(jìn)一步免疫細(xì)胞化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)

6、Annexin A1和Notch1在KG-1a和HL60細(xì)胞膜上共定位，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在KG-1a細(xì)胞中Annexin A1和Notch1存在相互作用?？紤]到Annexin A1敲降表達(dá)后會(huì)顯著提高Notch1的表達(dá)水平，故我們推測(cè)AnnexinA1與Notch1的相互作用可能促進(jìn)了Notch1在細(xì)胞內(nèi)的降解。為了驗(yàn)證此假設(shè)，我們選用泛素化降解途徑阻斷劑氯喹(chloroquine)來處理KG-1a細(xì)胞，Western blot

7、結(jié)果顯示，經(jīng)chloroquine刺激后，KG-1a細(xì)胞內(nèi)Notch1表達(dá)量顯著上調(diào)，提示在KG-1a中Annexin A1與Notch1相互作用后通過泛素化途徑促進(jìn)了Notch1的降解;且MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示chloroquine會(huì)時(shí)間和劑量依賴性地抑制KG-1a細(xì)胞增殖，提示在KG-1a細(xì)胞中經(jīng)chloroquine處理后上調(diào)Notch1的表達(dá)會(huì)抑制KG-1a細(xì)胞增殖。在KG-1a細(xì)胞和KG-1a-shAnnexin A1細(xì)胞構(gòu)建的荷