力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)P2X1受體介導(dǎo)大鼠血管收縮反應(yīng)的影響以及血管P2X受體亞型mRNA表達(dá)的研究.pdf

1、適度運(yùn)動(dòng)有利于健康，運(yùn)動(dòng)超過(guò)一定限度達(dá)到力竭狀態(tài)時(shí)則對(duì)機(jī)體造成一定的損傷。目前有關(guān)力竭運(yùn)動(dòng)損傷組織器官的研究主要集中在心臟，力竭運(yùn)動(dòng)可在分子水平和細(xì)胞水平造成心臟組織出現(xiàn)病理性改變，但是力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)不同血管的影響尚缺乏研究。眾所周知，支配血管的交感神經(jīng)末梢囊泡內(nèi)存在共遞質(zhì)NA和ATP。在血管神經(jīng)源性收縮反應(yīng)中，NA收縮成分和ATP收縮成分所占的比重可因動(dòng)物的種屬差異或血管的不同，而發(fā)生顯著改變。在P2X受體中，P2X1受體是介導(dǎo)嘌呤核苷酸

2、類激動(dòng)劑收縮血管作用的主要受體亞型。α,β-methylene ATP(α,β-MeATP)是研究P2X1受體介導(dǎo)血管收縮的重要工具藥，其給藥方式尚無(wú)定論。因此，本研究分析了不同方式給予α,β-MeATP對(duì)大鼠離體腸系膜動(dòng)脈P2X1受體介導(dǎo)血管收縮的影響；探討了力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠不同血管α1受體和P2X1受體介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)的抑制作用；以及P2X受體亞型mRNA在不同血管的表達(dá)水平。
　　 第一部分不同給藥方式對(duì)P2X1受體介導(dǎo)

3、大鼠腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)的影響
　　 制備大鼠離體腸系膜動(dòng)脈環(huán)標(biāo)本。利用受體藥理學(xué)技術(shù)觀察和分析α,β-MeATP非累積給藥和單濃度給藥兩種方式對(duì)P2X1受體介導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)的藥理學(xué)特征。
　　 1 腸系膜動(dòng)脈標(biāo)本的反應(yīng)性及標(biāo)本濕重
　　 在α,β-MeATP非累積給藥組、α,β-MeATP單濃度給藥組和NA對(duì)照組，首次累積給予NA(0.001-100μmol·L-1)誘發(fā)濃度依賴性血管收縮反應(yīng)。雙因素方

4、差分析結(jié)果顯示，三組血管標(biāo)本的NA量效曲線無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。三組腸系膜動(dòng)脈的標(biāo)本濕重分別為：0.82±0.16mg、0.82±0.11mg和0.86±0.05mg，標(biāo)本濕重在各組間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2 兩種方式給予α,β-MeATP誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)
　　 采用非累積給藥或單濃度給藥，α,β-MeATP(0.1-100μmol·L-1)均可使大鼠離體腸系膜動(dòng)脈產(chǎn)生濃度依賴性收縮反

5、應(yīng)。無(wú)論以KC1最大收縮反應(yīng)還是以標(biāo)本濕重標(biāo)化α,β-MeATP誘發(fā)的收縮反應(yīng)時(shí)，α,β-MeATP單濃度給藥誘發(fā)的收縮反應(yīng)均顯著大于α,β-MeATP非累積給藥的效應(yīng)(P＜0.01)。以標(biāo)本濕重標(biāo)化時(shí)，100μmol·L-1濃度的α,β-MeATP誘發(fā)的收縮反應(yīng)分別是0.71±0.10g·mg-1（單濃度組）和0.44±0.12g·mg-1(非累積組，P＜0.01)。以KC1最大收縮反應(yīng)標(biāo)化時(shí)，100μmol·L-1濃度的α,β-Me

6、ATP誘發(fā)的收縮反應(yīng)分別是48.57±11.52％（單濃度組）和38.00±2.52％（非累積組）。
　　 3 NA誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)
　　 前后兩輪給予NA(0.001-100μmol·L-1)均產(chǎn)生濃度依賴性收縮反應(yīng)。無(wú)論以KC1最大收縮反應(yīng)還是以標(biāo)本濕重標(biāo)化NA誘發(fā)的收縮反應(yīng)，前后兩輪NA誘發(fā)的濃度效應(yīng)曲線均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 4 KC1誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)
　　 在α,

7、β-MeATP非累積給藥組、α,β-MeATP單濃度給藥組和NA對(duì)照組，120mmol·L-1KC1誘發(fā)的收縮反應(yīng)分別是1.05±0.12g·mg-1、1.48±0.24g·mg-1和1.46±0.17g·mg-1。非累積組的KCl最大收縮反應(yīng)顯著低于單濃度組和NA對(duì)照組（P＜0.01）。
　　 第二部分 P2X1受體介導(dǎo)大鼠五種動(dòng)脈血管收縮效應(yīng)的生理學(xué)意義
　　 本研究采用離體血管技術(shù)，通過(guò)與α1受體介導(dǎo)收縮反應(yīng)的比較

8、，觀察P2X受體在大鼠胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈介導(dǎo)收縮反應(yīng)的藥理學(xué)特征；以及α,β-MeATP和NA對(duì)麻醉小鼠頸總動(dòng)脈血壓的影響。
　　 1 血管標(biāo)本濕重及血管反應(yīng)性
　　 胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈五種去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)標(biāo)本均分為兩組，一組用于觀察NA第二輪量效曲線，另一組用于觀察單濃度α,β-MeATP的血管收縮反應(yīng)。結(jié)果表明：NA組與α,β-MeATP組比較，五種動(dòng)脈的標(biāo)本濕重以

9、及標(biāo)本的血管反應(yīng)性無(wú)差別(P＞0.05)。
　　 2 KC1對(duì)胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈的收縮作用
　　 在胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈五種去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)，NA組與α,β-MeATP組比較，KC1誘發(fā)的最大收縮反應(yīng)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。KC1誘發(fā)各動(dòng)脈收縮反應(yīng)的EC50值介于16.77～29.89(mol·L-1)之間，α,β-MeATP組KC1誘發(fā)收縮反應(yīng)的EC50值顯著大于

10、NA組(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 3 NA對(duì)胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈的收縮作用
　　 在胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈五種去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)，再次累積給予NA(0.0001-100μmol·L-1)誘發(fā)濃度依賴性收縮反應(yīng)。以標(biāo)本濕重標(biāo)化NA誘發(fā)的收縮反應(yīng)時(shí)，NA誘發(fā)最大收縮反應(yīng)的序列為：尾動(dòng)脈＞腸系膜動(dòng)脈＞頸內(nèi)動(dòng)脈＞肺動(dòng)脈=胸主動(dòng)脈；以KC1最大收縮反應(yīng)標(biāo)化NA誘發(fā)的收縮反應(yīng)時(shí)

11、，NA誘發(fā)最大收縮反應(yīng)的序列為：頸內(nèi)動(dòng)脈＞胸主動(dòng)脈＞肺動(dòng)脈=腸系膜動(dòng)脈＞尾動(dòng)脈。NA誘發(fā)收縮反應(yīng)的-logEC50值(mol·L-1)為6.90～7.83，其效價(jià)序列為尾動(dòng)脈=腸系膜動(dòng)脈＜頸內(nèi)動(dòng)脈＜胸主動(dòng)脈=肺動(dòng)脈。
　　 4α,β-MeATP對(duì)胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈的收縮作用
　　 在胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈五種去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)，α,β-MeATP(0.1-100μmol·L-

12、1)誘發(fā)濃度依賴性收縮反應(yīng)。以標(biāo)本濕重標(biāo)化α,β-MeATP誘發(fā)的收縮反應(yīng)時(shí)，α,β-MeATP誘發(fā)最大收縮反應(yīng)的序列為：尾動(dòng)脈＞腸系膜動(dòng)脈＞頸內(nèi)動(dòng)脈＞肺動(dòng)脈=胸主動(dòng)脈；以KC1最大收縮反應(yīng)標(biāo)化α,β-MeATP誘發(fā)的收縮反應(yīng)時(shí)，α,β-MeATP誘發(fā)最大收縮反應(yīng)的序列為：頸內(nèi)動(dòng)脈=尾動(dòng)脈＞胸主動(dòng)脈＞肺動(dòng)脈=腸系膜動(dòng)脈。α,β-MeATP誘發(fā)收縮反應(yīng)的-logEC50值(mol·L-1)為4.86～5.93，其效價(jià)序列是肺動(dòng)脈=胸主動(dòng)脈

13、=頸內(nèi)動(dòng)脈＜尾動(dòng)脈=腸系膜動(dòng)脈。在胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和尾動(dòng)脈，以KC1最大收縮反應(yīng)(％KClEmax)標(biāo)化后，α,β-MeATP最大收縮反應(yīng)與NA最大收縮反應(yīng)的比值(Emax·α,β-MeATP/Emax·KCl)/(Emax·NA/Emax·KCl)分別是0.42、0.42、0.41、0.43和0.80。
　　 5 NA和α,β-MeATP對(duì)小鼠頸總動(dòng)脈血壓的影響
　　 經(jīng)尾靜脈給予α,β-MeAT

14、P10nmol·kg-1后，小鼠頸總動(dòng)脈血壓在10sec內(nèi)升高并達(dá)峰值，2min內(nèi)恢復(fù)到藥前水平。間隔20min重復(fù)注入此劑量時(shí)，與第一次靜脈給予α,β-MeATP比較，小鼠頸總動(dòng)脈SBP、DBP和MBP升高值無(wú)明顯差別(P＞0.05)。NA組與α,β-MeATP組比較，給藥前的動(dòng)脈血壓未見(jiàn)顯著差異(P＞0.05);NA和α,β-MeATP在1～30nmol·kg-1范圍內(nèi)升高SBP、DBP和MBP，并呈劑量依賴性。雙因素方差分析結(jié)果顯

15、示，α,β-MeATP升高小鼠血壓的作用明顯強(qiáng)于NA(P＜0.01)。30nmol·kg-1的α,β-MeATP使小鼠頸總動(dòng)脈SBP、DBP和MBP值升高了65.83±17.15mmHg，65.67±12.24mmHg和65.72±13.50mmHg，而同劑量的NA使小鼠頸總動(dòng)脈SBP、DBP和MBP值升高了36.83±11.23mmHg，33.33±12.01mmHg和34.50±11.53mmHg(P＜0.01)。
　　 第

16、三部分力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠不同血管α1受體和P2X1受體介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)的選擇性抑制作用
　　 將大鼠分為力竭游泳組和對(duì)照組，力竭組大鼠尾部負(fù)重體重3％的負(fù)荷，游泳至力竭為止，每日游泳1次，每周游泳6次，共2周。兩周后，采用離體血管技術(shù)和受體藥理學(xué)技術(shù)觀察α1受體和P2X1受體在大鼠肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈介導(dǎo)的收縮反應(yīng)及藥理學(xué)特征。
　　 1 力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)標(biāo)本濕重和KC1最大收縮反應(yīng)的影響
　　 與對(duì)照

17、組比較，力竭游泳組大鼠腸系膜動(dòng)脈的標(biāo)本濕重明顯大于對(duì)照組，血管標(biāo)本濕重分別是0.85±0.02mg和0.73±0.02mg(P＜0.01)。肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈的標(biāo)本濕重兩組間未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。在腸系膜動(dòng)脈和尾動(dòng)脈，KC1誘發(fā)的最大收縮反應(yīng)在力竭游泳組分別是1.46±0.06g·kg-1和2.85±0.10g·kg-1組織，在對(duì)照組分別是1.72±0.05g·kg-1和3.27±0.10g·kg-1組織，兩組間比較差異具

18、有顯著性(P＜0.01)。在肺動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，KC1誘發(fā)的最大收縮反應(yīng)在兩組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。在NA組中，KC1誘發(fā)收縮反應(yīng)的EC50值(mmol·L-1)為17.23～33.44，與對(duì)照組比較，力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)KC1的EC50值無(wú)明顯影響(P＞0.05）。
　　 2 肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈的反應(yīng)性
　　 在肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，首次累積給予NA(0.0001-100μmol·L-

19、1)時(shí)，均產(chǎn)生濃度依賴性血管收縮反應(yīng)。雙因素方差分析結(jié)果顯示：NA組與α,β-MeATP組比較，對(duì)照組大鼠各血管標(biāo)本的收縮反應(yīng)性無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；同樣，力竭游泳組大鼠各血管標(biāo)本的收縮反應(yīng)性無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3 力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)NA誘發(fā)肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈收縮反應(yīng)的影響
　　 在肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，再次累積給予NA(0.0001-100μmol·L-1)均產(chǎn)生

20、濃度依賴性收縮反應(yīng)。與對(duì)照組比較，力竭游泳運(yùn)動(dòng)明顯抑制大鼠肺動(dòng)脈和尾動(dòng)脈NA誘發(fā)的收縮反應(yīng)(P＜0.05），其最大抑制率分別是13.68％和9.48％；與肺動(dòng)脈和尾動(dòng)脈相比，力竭游泳運(yùn)動(dòng)抑制腸系膜動(dòng)脈NA誘發(fā)的收縮反應(yīng)更明顯，最大抑制率可達(dá)21.02％(P＜0.01)。而在頸內(nèi)動(dòng)脈，力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)NA誘發(fā)的收縮反應(yīng)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。NA誘發(fā)收縮反應(yīng)的-logEC50值(mol·L-1)為6.70～7.58，與對(duì)照組比較，力竭游

21、泳運(yùn)動(dòng)對(duì)NA的-logEC50值無(wú)明顯影響(P＞0.05)
　　 4 力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)α,β-MeATP誘發(fā)肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈收縮反應(yīng)的影響
　　 在肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，α,β-MeATP(0.1，1.0，10和100μmol·L-1)誘發(fā)濃度依賴性收縮反應(yīng)。與對(duì)照組比較，力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和尾動(dòng)脈α,β-MeATP誘發(fā)的收縮反應(yīng)無(wú)顯著影響(P＞0.05)；但是力竭游泳運(yùn)動(dòng)

22、使大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈α,β-MeATP誘發(fā)的收縮反應(yīng)明顯降低，最大抑制率為50.38％(P＜0.05)。α,β-MeATP誘發(fā)收縮反應(yīng)的-logEC50值(mol·L-1)為4.71～6.19，與對(duì)照組比較，力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)α,β-MeATP的-logEC50值無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　 第四部分大鼠不同血管組織P2X受體亞型mRNA表達(dá)的研究
　　 本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析了大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈、腸系膜

23、動(dòng)脈和尾動(dòng)脈五種血管P2X受體各亞型mRNA的表達(dá)；并進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，探討P2X受體mRNA在五種血管的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 1 RT-PCR法檢測(cè)P2X受體亞型mRNA在大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和尾動(dòng)脈的表達(dá)
　　 瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示，在大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和尾動(dòng)脈，管家基因HPRT mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物顯示與預(yù)期相同的特異性擴(kuò)增條帶；P2X1、P2X4和P

24、2X7受體mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物在各自相應(yīng)泳道出現(xiàn)與擴(kuò)增目的片段大小相同的特異性條帶；P2X2、P2X3、P2X5和P2X6受體mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物未出現(xiàn)明顯的特異性擴(kuò)增條帶。
　　 2 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和尾動(dòng)脈P2X1、P2X4和P2X7受體mRNA表達(dá)的對(duì)比分析
　　 頸內(nèi)動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈P2X1受體mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.05），但4者P2X1受體mRNA的表達(dá)水平顯

25、著低于尾動(dòng)脈（P＜0.01）。P2X4受體mRNA在肺動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和尾動(dòng)脈的表達(dá)水平無(wú)差別(P＞0.05)。P2X7受體mRNA的表達(dá)水平為：肺動(dòng)脈＜尾動(dòng)脈=胸主動(dòng)脈＜頸內(nèi)動(dòng)脈＜腸系膜動(dòng)脈(P＜0.01)。
　　 結(jié)論
　　 在大鼠離體腸系膜動(dòng)脈，非累積給予α,β-MeATP顯著降低P2X1受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)以及高鉀誘發(fā)的收縮反應(yīng)。研究P2X1受體介導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)時(shí)，非累積給藥方式可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

26、
　　 與α1受體介導(dǎo)的收縮效應(yīng)強(qiáng)度相比，P2X1受體介導(dǎo)的血管收縮效應(yīng)強(qiáng)度在大鼠胸主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈基本相同，而尾動(dòng)脈中該收縮成分明顯增大，提示嘌呤能血管收縮效應(yīng)在尾動(dòng)脈的生理功能上發(fā)揮著特殊作用。
　　 力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈P2X1受體和α1受體介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)的抑制作用不同于外周動(dòng)脈。P2X1受體介導(dǎo)的外周血管收縮效應(yīng)對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)中的防御反應(yīng)可能具有重要意義。
　　 P2X1受體mRN