P2Y受體介導大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)及相關(guān)受體亞型mRNA和受體蛋白的表達.pdf

1、本實驗研究了P2受體介導大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)的藥理學特點，并應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)絕對定量分析大鼠胃體平滑肌P2Y受體亞型mRNA的表達和免疫組織化學技術(shù)分析大鼠胃體平滑肌P2Y1與P2Y2受體的表達。
　　 第一部分核苷及核苷酸類物質(zhì)介導大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)的藥理學特點制備大鼠離體胃體和胃底環(huán)行肌標本。利用受體藥理學技術(shù)觀察大鼠胃體和胃底環(huán)行肌不同的藥理學特征，并進一步分析核苷及核苷酸類物質(zhì)誘發(fā)胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)的作用

2、特點。
　　 1CCh、5-HT、His和KC1對大鼠胃體環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌的作用在胃體環(huán)行肌KC1所致收縮反應(yīng)與胃底環(huán)行肌無顯著性差別；但是，CCh收縮胃體環(huán)行肌的EC50值（0.45±0.15μmol·L-1）顯著高于胃底環(huán)行?。?.20±0.09μmol·L-1，P<0.01）。5-HT和His收縮兩種標本的EC50值無顯著差異（P>0.05）；但是，在胃體環(huán)行肌5-HT和His產(chǎn)生收縮反應(yīng)的Emax值（0.81±0.26

3、和0.88±0.27g）顯著小于胃底環(huán)行?。?.67±0.61和1.90±0.68g，P<0.01）。
　　 2ATP對預收縮大鼠胃體環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌的作用在預收縮胃體環(huán)行肌，ATP（0.1-3000μmol·L-1）誘發(fā)濃度依賴性收縮反應(yīng)，未見舒張反應(yīng)；在預收縮胃底環(huán)行肌標本，同濃度ATP誘發(fā)先舒張后收縮的雙相反應(yīng)，并呈濃度依賴性。
　　 3核苷及核苷酸對大鼠胃體環(huán)行肌的作用。
　　 4酚妥拉明、普萘洛爾、阿

4、托品及河豚毒素對ATP和UTP誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)的影響。
　　 上述結(jié)果表明，大鼠胃體環(huán)行肌的藥理學特征明顯不同于胃底環(huán)行?。缓塑占昂塑账犷愇镔|(zhì)誘發(fā)大鼠收縮反應(yīng)的效價序列為2-MeSATP>>ADP>ATP=UTP>α，β-MeATP>>腺苷，提示通過P2Y受體介導胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)；核苷酸類物質(zhì)是調(diào)節(jié)胃體環(huán)行肌收縮功能的重要介質(zhì)。
　　 第二部分P2Y受體介導大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)的受體藥理學分析本研究以2-M

5、eSATP和UTP分別脫敏相應(yīng)的P2Y受體，觀察核苷酸類物質(zhì)誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)的變化；同時分析了P2受體阻斷劑蘇拉明和PPADS對核苷酸類物質(zhì)誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)的影響。
　　 1UTP和2-MeSATP脫敏P2Y受體對藥物誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)的影響ATP（30μmol·L-1）、UTP（3μmol·L-1）、ADP（3μmol·L-1）、2-MeSATP（0.03μmol·L-1）、α，β-MeATP（3μ

6、mol·L-1）、ACh（3μmol·L-1）、His（30μmol·L-1）和5-HT（3μmol·L-1）誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌的收縮反應(yīng)在給予溶媒前后均無顯著性差異（P>0.05）。UTP（9μmol·L-1）脫敏時，ATP、ADP、2-MeSATP和5-HT誘發(fā)的大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)顯著增高（P<0.05），其中ATP組增加了41.1％，ADP組增加了46.7％，2-MeSATP組增加了38.6％，5-HT組增加61.3％；而α，

7、β-MeATP、ACh和His誘發(fā)的收縮反應(yīng)無顯著性變化（P>0.05）。2-MeSATP（0.09μmol·L-1）脫敏時，ATP和ADP誘發(fā)的大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)明顯降低（P<0.01），其中ATP組降低了86.7％，ADP組的收縮反應(yīng)完全抑制；UTP、α，β-MeATP、ACh、His和5-HT誘發(fā)的收縮反應(yīng)無顯著性變化（P>0.05）。
　　 2蘇拉明和PPADS對ATP、UTP和2-MeSATP誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮

8、反應(yīng)的影響蘇拉明（100μmol·L-1）顯著抑制ATP（30μmol·L-1）、UTP（3μmol·L-1）和2-MeSATP（0.03μmol·L-1）誘發(fā)的大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)（P<0.01）；其中ATP組降低了79.0％，UTP組降低了93.3％，2-MeSATP組降低了87.1％。PPADS（30μmol·L-1）使UTP（3μmol·L-1）誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌的收縮反應(yīng)降低61.6％（P<0.01），而對ATP（30μmo

9、l·L-1）和2-MeSATP（0.03μmol·L-1）誘發(fā)的收縮反應(yīng)無明顯變化（P>0.05）。
　　 上述結(jié)果表明，大鼠胃體環(huán)行肌存在多種功能性P2Y受體亞型介導收縮反應(yīng)；2-MeSATP、ATP和ADP可能激動環(huán)行肌細胞的同一P2Y受體亞型產(chǎn)生收縮反應(yīng)，該收縮反應(yīng)可被P2Y2和P2Y4受體脫敏所增強。P2Y2和P2Y4受體脫敏對5-HT誘發(fā)收縮反應(yīng)的增強更為明顯。
　　 第三部分大鼠胃體平滑肌P2Y受體mRNA表

10、達的定量研究本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析了大鼠胃體平滑肌P2X受體亞型（P2X1-7）和P2Y受體亞型（P2Y1，2，4，6，11，12，13，14）mRNA的表達；并進一步應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，絕對定量分析P2Y1，2.4，6，12，13，14受體mRNA在大鼠胃體組織的表達水平。
　　 1RT-PCR法檢測P2X和P2Y受體亞型mRNA在大鼠胃體平滑肌的表達擴增產(chǎn)物使用2％瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示陽性對照β-ac

11、tinmRNA擴增產(chǎn)物顯示與預期相同的特異性條帶；P2X1.2，4，5，7和P2Y1，2，4，6，12，13，14受體mRNA擴增產(chǎn)物在各自相應(yīng)泳道出現(xiàn)與擴增目的片段大小相同的特異性條帶；P2X3，6和P2Y11受體mRNA擴增產(chǎn)物未出現(xiàn)擴增目的條帶。
　　 2實時熒光定量PCR法絕對定量分析大鼠胃體平滑肌P2Y受體mRNA的表達SYBR-green實時定量PCR檢測β-actinmRNA在大鼠胃體平滑肌的表達量為9，809，7

12、56.9拷貝數(shù)/10ng總RNA，顯著高于P2Y受體各亞型mRNA在大鼠胃體平滑肌的拷貝數(shù)（P<0.01）。各P2Y受體亞型mRNA在大鼠胃體環(huán)行肌表達強度順序為P2Y2>P2Y1>>P2Y12>P2Y6=P2Y14>P2Y13>P2Y4>P2Y11=0。P2Y2受體和P2Y1受體mRNA在大鼠胃體平滑肌的表達量分別為75，997.5±39，709.3和21，611.5±8，294.7（拷貝數(shù)/10ng，RNA），顯著高于其他P2Y受體

13、（P<0.01）。
　　 研究結(jié)果表明，除P2X3、P2X6和P2Y11受體亞型外，其他P2X和P2Y受體亞型的mRNA均表達于大鼠胃體平滑肌。大鼠胃體平滑肌P2Y受體亞型mRNA的絕對定量PCR分析結(jié)果表明，P2Y2受體和P2Y1受體mRNA是優(yōu)勢表達的P2Y受體，各受體亞型的表達強度順序為P2Y2>P2Y1>>P2Y12>P2Y6=P2Y14>P2Y13>P2Y4。
　　 第四部分P2Y1受體和P2Y2受體在大鼠胃體

14、平滑肌細胞的表達本研究應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)分析大鼠胃體平滑肌細胞（SMCs）P2Y1和P2Y2受體的表達，并對P2Y1和P2Y2受體在大鼠胃底與胃體的分布進行了比較。
　　 陰性對照組中，大鼠胃體和胃底全層標本無特異性著色。在大鼠胃體和胃底，粘膜固有層、粘膜肌、縱行肌、環(huán)行肌和肌間神經(jīng)叢可檢測到P2Y1和P2Y2受體免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物。腺體細胞和神經(jīng)元的胞漿和平滑肌細胞的細胞核出現(xiàn)強陽性著色。
　　 大鼠胃體環(huán)行肌SMCs

15、的P2Y1受體和P2Y2受體的陽性細胞率分別為33.08％±9.93％和45.17％±6.11％，顯著高于縱行肌和粘膜肌SMCs的陽性細胞率（P<0.01）；大鼠胃底縱行肌、環(huán)行肌和粘膜肌SMCsP2Y1受體和P2Y2受體的表達與胃體相似。在大鼠胃體和胃底的縱行肌和環(huán)行肌層，P2Y2受體的陽性細胞率顯著高于P2Y1受體（P<0.05）；大鼠胃體粘膜肌SMCs的表達與此類似。大鼠胃體縱行肌、環(huán)行肌和粘膜肌SMCsP2Y2受體的陽性細胞率顯

16、著低于胃底同類SMCs的陽性細胞率（P<0.05）；胃體縱行肌和粘膜肌SMCs的P2Y1受體陽性細胞率顯著低于胃底同類SMCs的陽性細胞率（P<0.05），而在環(huán)行肌SMCs間無顯著性差別（P>0.05）。
　　 研究結(jié)果表明，在大鼠胃體和胃底組織，P2Y1受體和P2Y2受體表達于環(huán)行肌、縱行肌和粘膜肌SMCs的細胞核；兩種受體在環(huán)行肌的表達顯著高于縱行肌和粘膜肌。P2Y1受體和P2Y2受體在胃體縱行肌和粘膜肌的表達顯著低于胃底

17、。此外，在大鼠胃體、胃底環(huán)行肌和縱行肌SMCs，P2Y2受體的表達顯著高于P2Y1受體；胃體粘膜肌SMCs的P2Y2表達亦顯著高于P2Y1。
　　 核苷酸類物質(zhì)使大鼠胃體環(huán)行肌產(chǎn)生濃度依賴性收縮反應(yīng)，是調(diào)節(jié)胃體環(huán)行肌收縮活動的重要介質(zhì)；大鼠胃體環(huán)行肌的藥理學特征明顯不同于胃底環(huán)行肌。
　　 大鼠胃體環(huán)行肌存在多種功能性P2Y受體亞型介導收縮反應(yīng)。2-MeSATP、ATP和ADP可能作用于環(huán)行肌細胞的同一P2Y受體亞型產(chǎn)生

18、收縮反應(yīng)，該收縮反應(yīng)可被P2Y2和P2Y4受體脫敏所增強。
　　 P2Y受體家族中的P2Y1受體和P2Y2受體mRNA在大鼠胃體平滑肌組織呈優(yōu)勢表達，各受體亞型mRNA的表達強度順序為P2Y2>P2Y1>>P2Y12>P2Y6=P2Y14>P2Y13>P2Y4。
　　 大鼠胃體和胃底組織中P2Y1和P2Y2受體在環(huán)行肌層SMCs的表達顯著高于縱行肌層，兩種受體在胃體縱行肌層SMCs的表達顯著低于胃底。在大鼠胃體、胃底的環(huán)