新型P2Y樣G蛋白偶聯(lián)受體GPR17在缺血性腦損傷中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 腦缺血再灌注損傷是高度復雜的病理過程，腦缺血誘導的神經元損傷和小膠質細胞炎癥是腦缺血后病變的主要特點。小膠質細胞是腦內主要的炎癥細胞，小膠質細胞的激活對于缺血后炎癥進程以及慢性神經功能的恢復具有重要的影響。腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP)、尿嘧啶核苷酸(UTP、UDP)、糖基化核苷酸(UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)等細胞外核苷酸以及半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括L

2、TC4、LTD4和LTE4)是兩類重要的細胞外信號分子，能夠交叉調節(jié)中樞神經系統(tǒng)的炎癥，其中包括腦缺血。
　　 GPR17原是一種G蛋白偶聯(lián)的孤兒受體(orphanreceptor)，在2006年被鑒定出來，在分子進化上與P2Y核苷酸受體和半胱氨酰白三烯受體均有交叉，是一種新型P2Y樣受體。GPR17是一個“二元受體”，半胱氨酰白三烯(LTC4、LTD4)及尿嘧啶核苷酸(UDP、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)均能激活GPR17

3、；但GPR17是否能歸類在白三烯受體，目前還不夠成熟。
　　 GPR17主要分布在腦內，其次為腎臟、心臟和血管內皮細胞，目前對GPR17的效應了解較少，正常時GPR17表達在腦、脊髓神經元和少突膠質細胞的前體細胞，星形膠質細胞不表達GPR17。GPR17能夠調節(jié)中樞神經系統(tǒng)少突膠質前體細胞的發(fā)育成熟，是髓鞘形成的細胞內計時器。GPR17是腦和脊髓損傷的感受器，免疫染色結果顯示損傷急性期GPR17表達升高，而用反義寡核苷酸手段敲低

4、GPR17的表達能夠控制急性永久性腦缺血損傷以及脊髓損傷的進展；然而，因缺乏GPR17選擇性拮抗劑和動物特異性抗體，GPR17是否參與腦缺血后神經元損傷、小膠質細胞的激活，以及是否對慢性腦缺血損傷也具有調節(jié)作用，尚待闡明。
　　 研究目的：
　　 本文擬觀察新型P2Y樣G蛋白偶聯(lián)受體GPR17對腦缺血誘導的神經元損傷及小膠質細胞激活的影響，做以下2個方面的研究：
　　 (1)觀察大鼠局灶性腦缺血后腦內GPR17的

5、時空表達特征及細胞定位，并干擾腦內GPR17表達，觀察對腦缺血急、慢性期神經元損傷和小膠質細胞激活的影響；
　　 (2)以RNA干擾技術，研究GPR17對OGD誘導的皮層細胞混合培養(yǎng)中神經元損傷和小膠質細胞激活的影響。
　　 研究方法：
　　 以線栓法制備大鼠局灶性腦缺血(MCAO)模型。采用免疫組織化學、免疫印跡、RT-PCR等方法，觀察腦內GPR17表達的時空特點，免疫熒光雙染觀察受體在腦內的分布。大鼠側腦室

6、埋管，注射GPR17siRNA，靶向沉默腦內GPR17表達，觀察對大鼠局灶性腦缺血急、慢性期神經元損傷和小膠質細胞激活的影響。
　　 在大鼠皮層細胞混合培養(yǎng)體系中，以缺氧缺糖(OGD)誘導缺血性損傷，以GPR17siRNA靶向沉默混合培養(yǎng)體系中GPR17的表達，觀察對OGD誘導的原代皮層細胞混合培養(yǎng)體系中神經元損傷和小膠質細胞激活的影響。
　　 研究結果：
　　 第一部分大鼠局灶性腦缺血后腦內新型P2Y樣G蛋白偶

7、聯(lián)受體GPR17表達增加介導神經元損傷和小膠質細胞激活
　　 大鼠MCAO后缺血中心區(qū)，GPR17蛋白在缺血再灌注12、24h和7、14d表達上調；缺血周邊區(qū)，再灌注3d內GPR17蛋白表達變化不大，而在再灌注7、14d明顯增高。與Westernblot結果相一致，RT-PCR的結果顯示在缺血后中心區(qū)，GPR17mRNA在缺血再灌注24h和7、14d表達上調；缺血周邊區(qū)，再灌注24h、3、14d明顯增高。免疫組織化學結果顯示GP

8、R17陽性細胞數(shù)在缺血后中心區(qū)和周邊區(qū)增多。免疫熒光結果顯示，正常大鼠腦組織中，GPR17主要表達于神經元、少突膠質細胞，室管膜細胞。MCAO后，在缺血中心區(qū)，再灌注24h后GPR17主要表達于損傷的神經元，少量表達于損傷的小膠質細胞和少突膠質細胞，再灌注14dGPR17主要表達于增生激活的小膠質細胞，部分表達于少突膠質細胞；在缺血周邊區(qū)，再灌注24h后GPR17主要表達于神經元，少量表達于小膠質細胞和少突膠質細胞，再灌注14d后GPR

9、17主要表達于神經元、部分增生的小膠質細胞和少突膠質細胞。星形膠質細胞不表達GPR17。
　　 經Westernblot及免疫熒光染色證實，大鼠側腦室給予GPR17siRNA成功抑制缺血后腦內GPR17表達。GPR17siRNA給藥后能顯著減輕缺血再灌注24h神經癥狀、減少腦梗死體積以及改善缺血中心區(qū)的神經元缺失；同樣，它也改善缺血再灌注14d腦萎縮和缺血周邊區(qū)的神經元缺失，還顯著抑制小膠質細胞的增生激活。
　　 這些結

10、果證實，缺血后腦內GPR17表達上調，介導腦缺血后急性期神經元損傷和亞急性/慢性期小膠質細胞增生和炎癥。
　　 第二部分GPR17干擾對OGD誘導的皮層細胞混合培養(yǎng)中神經元損傷和小膠質細胞激活的影響
　　 大鼠原代皮層細胞混合培養(yǎng)中，經Westernblot及免疫熒光染色證實，GPR17siRNA成功抑制GPR17表達。OGD/R(OGD1h恢復24h)誘導細胞活性下降，LDH釋放增加，PI染色結果顯示細胞壞死增加。GP

11、R17siRNA抑制OGD/R誘導的LDH釋放，提高細胞活性，并減少細胞壞死數(shù)目。并且，免疫熒光雙染結果顯示，細胞死亡以神經元死亡為主，少突膠質細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞死亡較少，GPR17siRNA主要減少神經元死亡。免疫熒光染色結果還顯示，GPR17siRNA能夠抑制小膠質細胞激活的形態(tài)變化。免疫熒光以及Westernblot結果顯示，敲低GPR17表達后CysLT1受體表達增加。
　　 上述結果提示，GPR17介導皮層

12、細胞混合培養(yǎng)中OGD誘導的神經元損傷和小膠質細胞激活。并且，GPR17與CysLT1受體亞型之間可能存在著相互調節(jié)。
　　 結論：
　　 1.在大鼠局灶性腦缺血后，腦內GPR17表達的時空分布特點以及GPR17siRNA干擾的結果表明，缺血后腦內GPR17表達上調，介導缺血后急性神經元損傷以及亞急性/慢性期的小膠質細胞激活。
　　 2.在大鼠皮層細胞混合培養(yǎng)中，GPR17RNA干擾的結果表明，GPR17介導OGD