GAS2-Calpain2軸維持白血病細胞的生長.pdf

1、目的：GAS2（生長抑制特異性蛋白2）調(diào)控細胞周期、凋亡和Calpain（鈣蛋白激酶）活性。GAS2-Calpain2軸在腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化中具有雙重作用，但關于GAS2-Calpain2軸在白血病細胞中的功能研究還非常有限，本研究旨在初步探討GAS2-Calpain2軸在白血病細胞生長中的功能及作用機制。
　　方法：
　　（1）利用實時定量PCR（Quantitative Real-time PCR，Q-RT-PCR）和Ca

2、lpain活性檢測等方法檢測各類白血病患者骨髓細胞及白血病細胞株中 GAS2的mRNA表達及Calpain的活性；
　　（2）Western blot和免疫熒光（Immunofluorescence，IF）技術檢測正常骨髓細胞、白血病患者骨髓細胞以及白血病細胞系中GAS2蛋白的表達；
　?。?）利用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒，轉(zhuǎn)導THP-1和Jurkat細胞，Q-RT-PCR和Western blot等方法檢測干擾效率，比較GA

3、S2沉默和對照細胞的增殖、集落生成和Calpain活性的差異；
　?。?）注射對照和GAS2沉默THP1至裸鼠皮下，比較它們生成腫瘤的能力；
　　（5）免疫共沉淀技術檢測GAS2與Calpain2在THP-1和Jurkat細胞中的相互作用，并研究Calpain2敲減在GAS2沉默誘導的生長抑制中的作用；
　　（6）比較GAS2沉默和對照慢性髓細胞白血?。–ML）患者CD34+細胞集落生成能力的差異。
　　結果：<

4、br>　?。?）119例不同類型白血病患者骨髓中GAS2較正常骨髓都顯著異常高表達；類似地，不同白血病細胞株中GAS2表達均較對照細胞顯著增高；Calpain活性在22例急性髓細胞白血?。ˋML）患者樣本中較正常骨髓顯著降低；
　?。?）免疫熒光染色顯示白血病細胞株CCRF-CEM、SHI-1、Jurkat、THP-1和K562中GAS2蛋白表達均明顯高于正常骨髓細胞；
　?。?）使用慢病毒遞送含shNC（包含一段無義的對照

5、shRNA核苷酸序列）和sh919﹑sh1206（分別以shGAS2＃1和shGAS2＃2表示，分別包含特異性沉默GAS2的shRNA核苷酸序列）至THP-1和Jurkat細胞，GAS2的mRNA和蛋白表達抑制率均＞60％；沉默GAS2顯著增強THP-1和Jurkat細胞的Calpain的活性并抑制細胞增殖和集落生成能力；
　?。?）GAS2沉默顯著抑制THP-1細胞的裸鼠皮下成瘤能力；
　?。?）通過免疫共沉淀證明了在Ju

6、rkat和 THP-1細胞中 GAS2特異性結合Calpain2而非Calpain1，在THP-1細胞中同時沉默GAS2和Calpain2能夠逆轉(zhuǎn)單獨沉默GAS2誘發(fā)的生長抑制；
　?。?）在CML干/祖細胞中沉默GAS2顯著抑制它們的集落生成能力。
　　結論：GAS2在多種人類白血病包括慢性髓細胞白血?。–ML）、急性淋巴細胞白血?。ˋLL）、急性髓細胞白血?。ˋML）均異常高表達。沉默GAS2在體內(nèi)和體外均能顯著抑制TH