TIPE2在白血病細(xì)胞中新功能的研究.pdf

1、背景：
　　腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)誘導(dǎo)的蛋白8家族樣蛋白2(TNF-αinducedprotein8like2，TNFAIP8L2，TIPE2)蛋白被認(rèn)為是一種非常關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)蛋白，TIPE2基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。白血病是一種發(fā)病率高，致死率高的惡性腫瘤，可引起骨髓造血干細(xì)胞的癌變，產(chǎn)生大量未分化的免疫細(xì)胞，這種類(lèi)型的細(xì)胞不能發(fā)揮正常的免疫調(diào)控功能，因此就會(huì)使正常的造

2、血系統(tǒng)受到影響，最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生。有報(bào)道顯示，TIPE2基因在淋巴細(xì)胞內(nèi)有高表達(dá)的現(xiàn)象，提示TIPE2基因在淋巴細(xì)胞的增殖、分化等功能中可能發(fā)揮著重要作用。近來(lái)有研究認(rèn)為T(mén)IPE2與腫瘤的發(fā)病有密切關(guān)系，但是其在白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用尚未明了。本課題收集了602例白血病伴有淋巴瘤混合發(fā)病病人的組織標(biāo)本，利用基因操縱技術(shù)上調(diào)或者下調(diào)白血病細(xì)胞中TIPE2的表達(dá)，并進(jìn)一步檢測(cè)了TIPE2基因?qū)Π籽〖?xì)胞的增殖、生長(zhǎng)周期、細(xì)胞凋亡和遷移

3、的影響，為深入探討TIPE2在白血病發(fā)病中的具體作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　目的：
　　探討TIPE2基因?qū)Π籽〖?xì)胞各種生物學(xué)功能的影響，以及其影響白血病發(fā)生、發(fā)展的具體作用機(jī)制。
　　方法：
　　將TIPE2基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)與pCMV-C-Flag和pEGFP-N2載體重組，構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒Flag-TIPE2和GFP-TIPE2，然后將重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)到白血病細(xì)胞K562中，加G418抗生素進(jìn)行藥物篩選后，

4、得到穩(wěn)定的亞細(xì)胞株K562-FLAG（對(duì)照）、K562-FLAG-TIPE2、K562-GFP（對(duì)照）和K562-GFP-TIPE2，以及經(jīng)pSilence4.1-CMVneo干擾沉默后篩選得到穩(wěn)定亞細(xì)胞株K562-Si-C（對(duì)照）和K562-SiTIPE2。用RT-PCR和qPCR方法檢測(cè)TIPE2基因mRNA的表達(dá)水平。用MTT染色法進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，并作出穩(wěn)定細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線圖，之后再用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況。用293T作為

5、蛋白表達(dá)系統(tǒng)，用細(xì)胞免疫組化方法檢測(cè)TIPE2表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。才用Transwell小室和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)對(duì)TIPE2基因敲低和過(guò)表達(dá)的情況下，白血病細(xì)胞遷移的變化。最后，用免疫印跡雜交方法檢測(cè)TIPE2過(guò)表達(dá)后對(duì)JNK1、Caspase3、Caspase8等蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討TIPE2在白血病中的作用。
　　結(jié)果：
　　用免疫組化方法檢測(cè)TIPE2的表達(dá)，結(jié)果顯示白血病組織中TIPE2表達(dá)陽(yáng)性率為69.3

6、％（417例）。利用基因操縱技術(shù)上調(diào)或者下調(diào)白血病K562細(xì)胞中TIPE2的表達(dá)水平，成功構(gòu)建TIPE2基因過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒并把其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中得到K562-FLAG(對(duì)照)、K562-FLAG-TIPE2、K562-GFP(對(duì)照)、K562-GFP-TIPE2、K562-Si-C（對(duì)照）和K562-SiTIPE2細(xì)胞亞克隆。過(guò)表達(dá)或者敲低白血病細(xì)胞中TIPE2后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TIPE2對(duì)白血病細(xì)胞的周期沒(méi)有明顯影響(

7、P＞0.05);用免疫印跡雜交法和免疫組化檢測(cè)cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-8，caspase-3，caspase-8等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIPE2能引起白血病細(xì)胞的凋亡(P＜0.05)。之后，在上調(diào)TIPE2后，經(jīng)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell小室檢測(cè)和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測(cè)）發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞生長(zhǎng)加快(P＜0.05)，遷移能力升高，而下調(diào)TIPE2可以使白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)減緩，遷移力降低(P＜