TIPE2蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖和炎癥的機(jī)制研究.pdf

1、本項(xiàng)目一方面以血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖介導(dǎo)的血管重構(gòu)為切入點(diǎn)，系統(tǒng)研究TIPE2在血管術(shù)后再狹窄(Restenosis)中的作用及其機(jī)制，另一方面以炎癥角度探討TIPE2通過調(diào)控巨噬細(xì)胞精氨酸代謝抑制炎癥的分子機(jī)制。
　　研究目的：
　　1.探討TIPE2蛋白在Restenosis發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制;
　　2.研究TIPE2調(diào)節(jié)精氨酸代謝抑制炎癥

2、的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　一、TIPE2蛋白調(diào)控Restenosis的機(jī)制研究
　　1.TIPE2對(duì)小鼠Restenosis發(fā)生發(fā)展的作用研究
　　1.1 Retenosis小鼠模型構(gòu)建
　　1.2 TIPE2重組腺病毒感染實(shí)驗(yàn)
　　1.3 HE染色及分析
　　1.4 EDU摻入實(shí)驗(yàn)
　　1.5 TUNEL染色
　　2.TIPE2調(diào)控Restenosis形成的機(jī)制研究

3、　　2.1小鼠原代VSMCs培養(yǎng)
　　2.2 TIPE2調(diào)控VSMCs增殖、細(xì)胞周期分布的研究
　　2.3 TIPE2調(diào)控VSMCs增殖的機(jī)制研究
　　2.4 TIPE2調(diào)控STAT3、ERK1/2信號(hào)通路的機(jī)制探討
　　二、TIPE2蛋白調(diào)控巨噬細(xì)胞精氨酸代謝的研究
　　1.巨噬細(xì)胞除菌功能檢測(cè)
　　2.TIPE2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建
　　3.腹腔巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)
　　4.細(xì)胞處理

4、　　5.小鼠模型構(gòu)建及分析
　　研究結(jié)果：
　　1.TIPE2蛋白抑制實(shí)驗(yàn)性Retenosis的發(fā)展
　　1.1 TIPE2過表達(dá)顯著抑制損傷引起的血管術(shù)后再狹窄。血管損傷6周時(shí)，TIPE2過表達(dá)組的NIA及I/M值分別為19.36±2.905×103μm2、0.8888±0.1374，顯著低于對(duì)照組的37.78±2.402×103μm2、1.885±0.1794。這些結(jié)果說明TIPE2可以抑制小鼠Restenosis

5、的發(fā)生發(fā)展。
　　1.2 TIPE2缺失促進(jìn)VSMCs增殖，但對(duì)細(xì)胞凋亡沒有明顯影響。損傷后第7天，TIPE2缺失組的血管中膜EDU陽性細(xì)胞率顯著高于WT組（TIPE2-/-vs.WT,21.69±2.639％ vs.9.58±1.625％,P=0.0175），而TUNEL陽性細(xì)胞率則與WT組沒有顯著性差異（TIPE2-/-vs.WT，5.77±1.925％ vs.6.03±1.310％，P=0.9136），提示TIPE2主要通過

6、調(diào)控VSMC增殖抑制Restenosis的發(fā)生發(fā)展。
　　1.3損傷及PDGF-BB刺激顯著上調(diào)VSMCs的TIPE2表達(dá)
　　PDGF-BB刺激原代培養(yǎng)的VSMCs可以顯著上調(diào)TIPE2 mRNA及蛋白表達(dá)。與此相似，損傷后第7天、14天，WT模型小鼠的血管中膜TIPE2表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)，但第14天的表達(dá)強(qiáng)度低于第7天，總體上呈現(xiàn)升高后逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)。
　　1.4 TIPE2通過調(diào)控Cyclin D1、Cy

7、clin D3的表達(dá)抑制VSMCs增殖
　　體外利用PDGF-BB刺激WT、TIPE2-/-VSMCs，分析細(xì)胞周期分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIPE2缺失加快細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，并伴隨著Cyclin D1、CyclinD3的上調(diào)。而TIPE2過表達(dá)則顯著下調(diào)D型周期蛋白表達(dá)及細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換效率，從而抑制細(xì)胞增殖。TIPE2 R24A突變體（該突變體基本喪失與Rac1結(jié)合能力）對(duì)細(xì)胞周期蛋白及周期轉(zhuǎn)換均沒有明顯影響，提示TIPE2對(duì)

8、細(xì)胞增殖的調(diào)控可能依賴于Rac1信號(hào)通路。
　　1.5 TIPE2通過抑制Rac1-STAT3、Rac1-ERK信號(hào)通路調(diào)控VSMCs增殖
　　比較Rac1、STAT3及ERK信號(hào)分子在WT及TIPE2-/-VSMCs的活化水平差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIPE2缺失顯著增強(qiáng)Rac1、STAT3以及ERK的活化，而TIPE2過表達(dá)則結(jié)果相反。此外，Rac1抑制劑NSC23766抑制Rac1的活性后，TIPE2對(duì)STAT3及ERK1/2的

9、抑制作用消失，聯(lián)合應(yīng)用STAT3、ERK1/2抑制劑處理VSMCs，TIPE2缺陷導(dǎo)致的Cyclin D1、Cyclin D3表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象消失，說明TIPE2主要通過Rac1-STAT3、Rac1-ERK信號(hào)通路調(diào)控VSMCs增殖。
　　1.6 TIPE2調(diào)控STAT3活化后核轉(zhuǎn)位的機(jī)制
　　TIPE2可以抑制STAT3活化，TIPE2基因缺失顯著促進(jìn)STAT3在細(xì)胞核內(nèi)的募集。進(jìn)一步利用活化突變體STAT3-C過表達(dá)的HE

10、K293細(xì)胞以及WT VSMCs研究TIPE2是否對(duì)活化后STAT3入核過程具有直接調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIPE2及Rac1抑制劑能夠顯著抑制STAT3-C的入核，且TIPE2的抑制作用能夠被Rac1-Q61L（Rac1活化突變體）消除，說明TIPE2以Rac1依賴方式調(diào)控STAT3的核轉(zhuǎn)位過程。
　　2.TIPE2通過調(diào)控巨噬細(xì)胞精氨酸代謝抑制炎癥反應(yīng)
　　2.1 TIPE2基因缺失增強(qiáng)NO介導(dǎo)的抗菌作用
　　與WT相

11、比，TIPE2-/-腹腔巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗菌功能（殺菌率:TIPE2-/-vs.WT，68.57±4.234％ vs.46.53±4.347％，P=0.0221），而iNOS抑制劑1400w處理能顯著縮小兩者的差距（TIPE2-/-vs.WT，51.93±3.726％ vs.36.87±5.095％，P=0.0378），說明TIPE2缺失促進(jìn)NO介導(dǎo)的殺菌作用。
　　2.2 TIPE2過表達(dá)降低Raw264.7巨噬細(xì)胞的iNOS

12、水平，同時(shí)促進(jìn)精氨酸酶Ⅰ的表達(dá)
　　巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生主要依賴于iNOS。為了研究TIPE2是否調(diào)控iNOS表達(dá)，我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)TIPE2的Raw264.7巨噬細(xì)胞系， LPS刺激后檢測(cè)iNOS表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIPE2過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)精氨酸酶Ⅰ(ArginaseⅠ，ARG1)的mRNA水平，而對(duì)精氨酸酶Ⅱ(ArginaseⅡ，ARG2)則沒有明顯的影響。這些結(jié)果提示，TIPE2可能通過調(diào)

13、控iNOS與ARG1的表達(dá)水平，影響精氨酸代謝途徑的轉(zhuǎn)換。
　　2.3 TIPE2過表達(dá)抑制Raw264.7巨噬細(xì)胞NO、但促進(jìn)尿素(Urea)的產(chǎn)生
　　Arginase與iNOS均以精氨酸(Arginine)為底物，在精氨酸代謝上互為競(jìng)爭關(guān)系。為了證明TIPE2調(diào)節(jié)iNOS及ARG表達(dá)水平確實(shí)改變了巨噬細(xì)胞在精氨酸代謝上的傾向，我們對(duì)這兩個(gè)酶的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIPE2過表達(dá)細(xì)胞的尿素水平比對(duì)照組高，而NO水平則

14、顯著低于對(duì)照組，說明TIPE2過表達(dá)調(diào)控Raw264.7巨噬細(xì)胞的精氨酸代謝途徑選擇傾向，導(dǎo)致精氨酸代謝從iNOS途徑轉(zhuǎn)向arginase途徑。
　　2.4 TIPE2缺失促使巨噬細(xì)胞精氨酸代謝從iNOS向arginase途徑轉(zhuǎn)換
　　進(jìn)一步利用TIPE2缺陷的巨噬細(xì)胞反向驗(yàn)證TIPE2調(diào)控精氨酸代謝的功能，發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后TIPE2-/-巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)水平、NO水平顯著高于WT細(xì)胞;而ARG1 mRNA及尿素水平則

15、顯著低于對(duì)照組。該結(jié)果從功能缺失的角度進(jìn)一步驗(yàn)證TIPE2改變巨噬細(xì)胞精氨酸代謝傾向的功能。
　　2.5 TIPE2缺陷促進(jìn)小鼠體內(nèi)iNOS表達(dá)及NO產(chǎn)生
　　利用敗血癥模型小鼠體內(nèi)驗(yàn)證TIPE2調(diào)控精氨酸代謝的功能，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后，TIPE2缺陷小鼠肝、肺組織的iNOS mRNA及蛋白水平顯著高于WT小鼠，其血清NO也比WT小鼠高;相應(yīng)的，TIPE2-/-小鼠肝、肺組織里的ARG1的表達(dá)水平則比WT小鼠低。
　　2

16、.6 TIPE2缺陷促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞NF-κB、JNK及p38信號(hào)通路的活化
　　文獻(xiàn)報(bào)道，NF-κB、MAPK信號(hào)通路是LPS上調(diào)巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)重要機(jī)制。因此，我們檢測(cè)了WT、TIP2-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的通路活化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIPE2缺失后IκB的磷酸化水平及降解程度均顯著提高，JNK及p38磷酸化水平也明顯提高，而ERK1/2活化僅有微弱的增強(qiáng)。該結(jié)果提示TIPE2可能主要通過NF-κB、JNK及p3

17、8信號(hào)通路抑制iNOS表達(dá)及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　研究結(jié)論：
　　1.TIPE2通過抑制VSMCs增殖抗實(shí)驗(yàn)性Restenosis。TIPE2抑制Rac1導(dǎo)致下游ERK1/2以及STAT3活化、入核等過程受阻是TIPE2抑制VSMCs增殖、抵抗Restenosis的主要分子機(jī)制。
　　2.TIPE2抑制LPS引起的iNOS上調(diào)，使巨噬細(xì)胞中精氨酸優(yōu)先代謝為尿素，從而發(fā)揮抗炎作用。
　　創(chuàng)新點(diǎn)及意義：