TIPE2與哮喘患者凝血物質(zhì)TF、TSP-1的相關(guān)性及其機(jī)制研究.pdf

1、背景
　　支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病。大量研究表明，支氣管哮喘與高凝狀態(tài)密切相關(guān)，哮喘炎癥與凝血功能紊亂相互作用，共同促進(jìn)支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展。
　　組織因子（tissue factor，TF）是外源性凝血途徑的重要啟動(dòng)子，也是連接凝血與炎癥網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的關(guān)鍵分子。TF除了其促凝活性，還可與相應(yīng)配體結(jié)合，激活脈管系統(tǒng)中炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。反過來，炎癥因子可促進(jìn)上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá) TF。研究表明，哮喘患者血漿 TF含量和活

2、性升高，加重哮喘病情，促進(jìn)氣道重塑。盡管如此，TF在支氣管哮喘凝血與炎癥過程中的作用機(jī)制仍需大量研究進(jìn)行闡明。
　　凝血酶敏感蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）是血小板α顆粒中的糖基質(zhì)蛋白。在炎癥因子的誘導(dǎo)下，TSP-1可由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌釋放至血液循環(huán)，參與血小板黏附與聚集，在血栓性疾病中發(fā)揮重要作用。TSP-1可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化至炎性部位，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥

3、反應(yīng)。研究表明，TSP-1在多種肺疾病如慢性阻塞性肺疾病、慢性肺心病中異常表達(dá)，但其在支氣管哮喘中的研究較少。
　　腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8樣因子2（tumor necrosis factorαinduced protein-8 like-2，TIPE2）是新近發(fā)現(xiàn)的免疫負(fù)性調(diào)節(jié)分子，主要表達(dá)在免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其在調(diào)節(jié)免疫平衡和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。研究表明， TIPE2在兒童哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（perip

4、heral blood mononuclear cells， PBMCs）中表達(dá)下降，在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中TIPE2可通過p38MAPK以及ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)TF的表達(dá)。但在哮喘中TIPE2與凝血物質(zhì)之間的關(guān)系尚未明確。本研究旨在探討哮喘患者PBMCs中TIPE2、TF及血漿中TF、TSP-1的表達(dá)情況及TIPE2與凝血物質(zhì)TF、TSP-1的相關(guān)性。此外，由于屋塵螨是最常見、危害最大的室內(nèi)變應(yīng)原，是哮喘在世界范圍內(nèi)的重要發(fā)病原因。且

5、血源性TF主要來源于單核細(xì)胞，單核細(xì)胞來源的 TF微?；钚宰顝?qiáng)。 TIPE2、TF在一定條件下均可在單核細(xì)胞中表達(dá)。因此我們選取單核細(xì)胞系 THP-1細(xì)胞作為載體，探討屋塵螨提取液（house dust mite extract，HDME）刺激下THP-1細(xì)胞中TIPE2和TF的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制。
　　目的
　　研究TIPE2與支氣管哮喘患者凝血物質(zhì)TF、TSP-1的相關(guān)性；并進(jìn)一步探討屋塵螨提取液刺激的THP-1細(xì)胞中TIP

6、E2和TF的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路變化，為支氣管哮喘的診斷和治療提供新思路。
　　材料與方法
　　1.收集2015年12月~2016年6月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院確診的支氣管哮喘患者65例作為病例組，同時(shí)納入同時(shí)期年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的健康體檢者40例作為健康對(duì)照組。
　　2.采用Western blot檢測哮喘病例組和健康對(duì)照組PBMCs中TIPE2、TF蛋白表達(dá)水平。
　　3.采用ELISA檢測哮喘患

7、者和健康者血漿中TF、TSP-1的表達(dá)水平。
　　4.采用RT-PCR檢測屋塵螨提取液刺激THP-1細(xì)胞后，THP-1細(xì)胞中TIPE2、TF mRNA的表達(dá)水平。
　　5.采用 western blot檢測屋塵螨提取液刺激 THP-1細(xì)胞后，p38MAPK、NF-κB信號(hào)通路蛋白的變化情況。
　　結(jié)果
　　第一部分支氣管哮喘患者TIPE2與TF、TSP-1中的表達(dá)及相關(guān)性研究
　　1.與健康對(duì)照相比，哮喘患

8、者PBMCs中TIPE2蛋白表達(dá)水平降低（p<0.01）， TF蛋白表達(dá)水平明顯升高（p<0.01）。
　　2.與健康對(duì)照相比，哮喘患者血漿中TF、TSP-1蛋白表達(dá)水平均明顯升高（p<0.01）。
　　3.支氣管哮喘患者PBMCs中TIPE2蛋白表達(dá)水平與PBMCs和血漿中TF蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.3828，p<0.01；r=-0.5422，p<0.01）。此外，PBMCs中TIPE2蛋白表達(dá)水平與患者血漿中T

9、SP-1蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.3013， p<0.05）。
　　第二部分屋塵螨提取液刺激THP-1細(xì)胞后TIPE2、TF的表達(dá)及p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路變化研究
　　1.不同濃度（0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml）屋塵螨提取液刺激THP-1細(xì)胞4h后，TIPE2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，TF mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（p<0.05），且在刺激濃度1μg/ml時(shí)變化最為明顯（p<0.05）。選用

10、1μg/ml屋塵螨提取液刺激THP-1細(xì)胞不同時(shí)間（1h，2h，4h，8h）后，TIPE2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降（p<0.05），TF mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高（p<0.05），且在刺激4h時(shí)最為顯著（p<0.05）。
　　2.1μg/ml屋塵螨提取液刺激THP-1不同時(shí)間后（0min，15min，30min，1h）， p38MAPK、NF-κB蛋白磷酸化水平隨著時(shí)間的增加表達(dá)逐漸增高，且在1h時(shí)升高最明顯。
　　結(jié)論<

11、br>　　1.哮喘患者PBMCs中TIPE2蛋白表達(dá)水平降低、TF蛋白表達(dá)水平升高，血漿中TF、TSP-1蛋白水平升高。哮喘患者PBMCs中TIPE2與凝血物質(zhì)TF、TSP-1水平呈負(fù)相關(guān)。提示TIPE2可能通過與TF、TSP-1相互作用參與哮喘患者高凝狀態(tài)。
　　2.初步證實(shí)屋塵螨提取液可誘導(dǎo)THP-1中TIPE2 mRNA表達(dá)水平降低，TF mRNA表達(dá)水平升高，且可引起THP-1細(xì)胞中p38MAPK、NF-κB蛋白磷酸化信號(hào)