哮喘大鼠凝血酶活性與氣道重塑的相關(guān)性研究.pdf

1、支氣管哮喘(broncahial asthma)簡(jiǎn)稱哮喘，是一種常見的呼吸道疾病，其特征為氣道炎癥細(xì)胞的存在和氣道結(jié)構(gòu)的改變即“氣道重塑”，可導(dǎo)致不可逆的氣道阻塞、氣道高反應(yīng)、肺功能下降等。其中，氣道重塑是由于持續(xù)性的炎癥反應(yīng)和上皮細(xì)胞的損傷而導(dǎo)致的，現(xiàn)在已經(jīng)非常清楚氣道重塑可導(dǎo)致難以治療的嚴(yán)重哮喘。很多研究表明，支氣管平滑肌細(xì)胞(ASMC)在氣道重塑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，不僅通過它們的收縮功能，更重要的是，通過很多介質(zhì)作用于哮喘狀態(tài)，但其

2、機(jī)制尚未確定。目前哮喘的治療主要以控制癥狀為主，故探討哮喘氣道重塑的發(fā)生機(jī)制對(duì)哮喘的預(yù)防與治療具有重大意義。很多研究表明，凝血酶在氣道重塑的過程中起重要的作用。我們通過建立哮喘大鼠模型探討凝血酶活性與哮喘氣道重塑的相關(guān)性。
　　我們此研究分為二部分:①凝血酶通過PAR-1激活ERK1/2信號(hào)調(diào)控哮喘大鼠氣道重塑;②哮喘大鼠凝血酶、氣道炎癥、氣道重塑的相關(guān)性研究
　　第一部分 凝血酶通過PAR-1激活ERK1/2信號(hào)調(diào)控哮喘大

3、鼠氣道重塑
　　目的：
　　氣道重塑是氣流阻塞的原因，是哮喘病理生理變化的核心，其特點(diǎn)是氣道平滑肌肥厚和其他一些變化，包括基底膜增厚、上皮細(xì)胞缺失、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增生。導(dǎo)致這些變化的確切的介質(zhì)及其調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍不明確。而氣道重塑對(duì)哮喘有非常重要的影響:氣道高反應(yīng)性、不可逆的氣流受限、哮喘急性發(fā)作甚至導(dǎo)致患者死亡。因此，更深入的研究氣道重塑的機(jī)制是非常重要而且必須的。凝血酶是在血液凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)中形成的，除了其蛋白水解作

4、用，凝血酶可以通過激活蛋白酶激活受體啟動(dòng)許多細(xì)胞。而近年來研究表明，凝血酶除了在凝血機(jī)制中的中心作用，在氣道炎癥和氣道重塑中亦有重要作用[1]，但具體機(jī)制尚不明了。
　　支氣管平滑肌細(xì)胞(ASMC)在氣道重塑中具有重要作用。支氣管平滑肌的變化程度與哮喘的嚴(yán)重程度相關(guān)。已證實(shí)ASMC是豐富的促炎癥因子的來源，如細(xì)胞因子、趨化因子，并且作用于氣道重塑中的細(xì)胞增殖、遷移和炎癥細(xì)胞相互作用。
　　細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)是絲裂原

5、活化蛋白激酶(MAPK)的一條重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，ERK1和ERK2是其中研究最完善的，它們通過磷酸化激活，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等[2]。pERK1/2為其磷酸化水平，可調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞的異常增殖和分泌細(xì)胞因子，參與氣道重塑[3]。
　　蛋白酶活化受體-1（PAR-1）是一個(gè)G-耦合的、可以被絲氨酸蛋白酶（如凝血酶）激活的膜蛋白。其原名凝血酶受體，當(dāng)凝血酶切割其氨基酸端的特定位置時(shí)被激活。PARs分布廣泛，其中PAR-

6、1可表達(dá)在所有類型的細(xì)胞中[4]。在呼吸系統(tǒng)中，PAR-1表達(dá)在上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。因此，我們提出了一個(gè)假設(shè)，即凝血酶通過PAR-1激活ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)而參與哮喘大鼠氣道重塑。
　　方法：
　　將36只雌性大鼠隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組(SAL組)、哮喘模型組(OVA+SAL組)、凝血酶組（OVA+thrombin組）、水蛭素組（OVA+hirudin組）、凝血酶+pERK1/2抑制劑PD98059組（OVA+thr

7、ombin+ pERK1/2-inh組）、凝血酶+PAR-1抑制劑ER-112780-06組（OVA+thrombin+PAR-1-inh組），每組6只。以卵蛋白(OVA)致敏并吸入激發(fā)制備大鼠哮喘模型。模型組于第1、8天注射卵蛋(1ml/kg)，第15天始霧化2％卵蛋白（現(xiàn)配）每次30分鐘，每周3次，共6周，SAL組以生理鹽水代替。第15天起霧化前，OVA+thrombin組進(jìn)行凝血酶霧化吸入72u/只，OVA+hirudin組進(jìn)行h

8、irudin氣溶膠2000AUT吸入，OVA+thrombin+ pERK1/2-inh組霧化凝血酶霧化吸入72u/只后每只腹腔注射PD98059(3mg/kg)，OVA+thrombin+PAR-1-inh組進(jìn)行凝血酶霧化吸入72u/只及濃度為20uM的ER-112780-06霧化吸入30分鐘，其他各組以生理鹽水代替。造模結(jié)束后，取大鼠肺組織，用免疫組化、western blot及PCR檢測(cè)PAR-1的表達(dá)，用western blot

9、檢測(cè)pERK1/2的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.一般表現(xiàn)
　　實(shí)驗(yàn)前各組大鼠行為能力正常，在造模過程中，模型組均出現(xiàn)不同程度的異常表現(xiàn)。
　　SAL組:在激發(fā)時(shí)無煩躁不安，呼吸平穩(wěn)，行動(dòng)靈敏，生活習(xí)性正常，毛色有光澤。
　　OVA+SAL組:在激發(fā)時(shí)均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等癥狀，嚴(yán)重者呼吸減慢或節(jié)律不齊，行動(dòng)遲緩或俯伏不動(dòng)。經(jīng)過多次激發(fā)后，OVA+SAL組上述癥狀反而有所減

10、輕，毛色無光澤。
　　OVA+thrombin組:在激發(fā)時(shí)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等癥狀非常明顯，比OVA+SAL組嚴(yán)重;后期則多俯伏不動(dòng)，毛色暗黃色，有一只死亡。
　　OVA+hirudin組:在激發(fā)時(shí)有輕度煩躁不安、呼吸略增快，無呼吸減慢或節(jié)律不齊，與OVA+thrombin組相比較癥狀明顯減輕。
　　2.氣道重塑
　　OVA+SAL組與SAL組比較，平滑肌增厚。
　　OVA+throm

11、bin組與OVA+SAL組比較，平滑肌增厚更明顯。
　　OVA+hirudin組與OVA+thrombin組相比較，平滑肌無明顯增厚。
　　OVA+thrombin+pERK1/2-inh組、OVA+thrombin+PAR-1-inh組分別與OVA+thrombin組相比平滑肌增厚不明顯。
　　結(jié)論：
　　1.凝血酶可以上調(diào)大鼠呼吸道PAR-1的基因與蛋白表達(dá);
　　2.凝血酶可通過PAR-1激活ERK1

12、/2信號(hào)通路;
　　3.凝血酶激活pERK1/2信號(hào)通路，從而參與哮喘大鼠氣道重塑。
　　第二部分 哮喘大鼠凝血酶、氣道炎癥、氣道重塑的相關(guān)性研究
　　目的：
　　氣道炎癥是急、慢性肺的發(fā)病機(jī)理，哮喘即包括在內(nèi)。傷害性的刺激物可以激活各種細(xì)胞，包括嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，釋放血管活性物質(zhì)、有毒代謝物和細(xì)胞因子，從而參與急性和慢性支氣管收縮。IL-6即是參與其中的一個(gè)細(xì)胞

13、因子，亦是一種炎癥存在的生化指標(biāo)。研究證實(shí)，凝血酶通過介導(dǎo)NF-κ B的激活參與了氣道雁陣反應(yīng)。claudin-1作為一種縫隙連接蛋白，多表達(dá)于上皮細(xì)胞膜，保護(hù)肺組織免受病原體的侵害。研究表明[5]，哮喘患者肺組織中緊密連接帶變薄或被破壞。而反復(fù)的炎癥刺激可引起組織損傷及后續(xù)的組織結(jié)構(gòu)改變即氣道重塑。本實(shí)驗(yàn)外源性給予凝血酶及凝血酶抑制劑，建立標(biāo)準(zhǔn)大鼠哮喘動(dòng)物模型。通過ELISA法、HE染色、免疫熒光檢測(cè)、免疫組化、western blo

14、t等試驗(yàn)方法，探討凝血酶對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的影響，從而為凝血酶促進(jìn)哮喘氣道重塑機(jī)制的探討提供新的思路。
　　方法：
　　將24只雌性大鼠隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(SAL組)、哮喘組(OVA+SAL組)、凝血酶組（OVA+thrombin組）、凝血酶抑制劑組（OVA+hirudin組），每組6只。參照文獻(xiàn)方法制備大鼠哮喘模型。第15天開始用402超聲霧化器予大鼠霧化吸入2％OVA懸液50ml（現(xiàn)配），每次30分鐘，每周3次，連

15、續(xù)激發(fā)6周。霧化前30分鐘，OVA+thrombin組每只大鼠給予霧化吸入凝血酶72u，OVA+hirudin組每只大鼠給予霧化吸入水蛭素(500u/kg)。SAL組用生理鹽霧化。
　　結(jié)果：
　　1.肺組織炎癥浸潤(rùn)情況觀察
　　OVA+SAL組:支氣管壁、間隔及血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與SAL組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　OVA+thrombin組炎癥浸潤(rùn)情況較OVA+SAL組更為明顯（P＜0

16、.05）。
　　OVA+hirudin組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕較OVA+thrombin組減輕（P＜0.05）。
　　2.免疫熒光檢測(cè)claudin-1的表達(dá)
　　OVA+SAL組氣道上皮細(xì)胞胞膜claudin-1表達(dá)減少，上皮完整性稍有破壞與SAL組比較有差異。
　　OVA+thrombin組氣道上皮細(xì)胞胞膜claudin-1表達(dá)微弱，上皮完整性破壞嚴(yán)重，與OVA+SAL組比較有差異。
　　OVA+hirudi

17、n組claudin-1陽性表達(dá)細(xì)胞較OVA+thrombin組增多。
　　3.免疫組織化學(xué)法肺組織中IL-6的表達(dá)結(jié)果
　　OVA+SAL組較SAL組IL-6表達(dá)增多（P＜0.05）。
　　OVA+thrombin組IL-6陽性表達(dá)較OVA+SAL組明顯（P＜0.05)。
　　OVA+hirudin組較OVA+thrombin組IL-6表達(dá)減少（P＜0.05)。
　　4.Western Blot法檢測(cè)肺組織

18、中NF-κB蛋白表達(dá)的結(jié)果
　　OVA+SAL組較SAL組肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)增加（P＜0.05)。
　　OVA+thrombin組較OVA+SAL組肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)增高（P＜0.05)。
　　OVA+hirudin組較OVA+thrombin組肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.凝血酶促進(jìn)哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng);
　　2.凝血酶可導(dǎo)致哮喘大鼠氣道上皮c