卡介苗對哮喘大鼠氣道炎癥及重塑的影響.pdf

1、目的：探討卡介苗對哮喘大鼠氣道炎癥及重塑的預防作用及可能機制，以α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、白介素-4(IL-4)和γ-干擾素(IFN-γ)為指標，用IFN-γ/IL-4間接反映Th1/Th2水平，反應炎癥指標，CyclinD1、α-SMA反映重塑指標，觀察卡介苗是否可以調整Th1/Th2平衡，減輕氣道炎癥，延緩氣道重塑發(fā)生，從而改善哮喘癥狀，控制哮喘發(fā)展速度及可能機制。
　　 方法：

2、清潔級SD雄性大鼠40只，4周齡，體重50-100克之間，隨機分成正常對照組、哮喘模型組、多BCG接種組、BCG干預組每組10只。
　　 1、正常對照組(NS group)：所有的幼鼠于實驗第1、8天對幼鼠腹腔注射生理鹽水2mL進行致敏，第15天起將幼鼠置于自制的密閉霧化吸入箱內，予生理鹽水5mL霧化吸入30min，隔日1次，共激發(fā)20次，每次30min。
　　 2、哮喘模型組(asthma group)：所有的幼鼠于實

3、驗第1、8天對幼鼠腹腔注射OVA100mg和氫氧化鋁100mg（混于9g/L生理鹽水2mL中）進行致敏，第15天起將幼鼠置于自制的密閉霧化吸入箱內，予2％OVA生理鹽水5mL霧化吸入30min，隔日1次，共激發(fā)20次，每次30min，以出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸急促、活動量下降典型的哮喘發(fā)作的癥狀為激發(fā)成功。
　　 3、多BCG接種組(multiple BCG vaccination group)：在OVA致敏前7、3、1天，每只幼鼠

4、分別皮內注射BCG0.025mg，于實驗第1、8天對幼鼠腹腔注射OVA100mg和氫氧化鋁100mg（混于9g/L生理鹽水2mL中）進行致敏，第15天起將幼鼠置于自制的密閉霧化吸入箱內，予2％OVA生理鹽水5mL霧化吸入30min，隔日1次，共激發(fā)20次，每次30min，以出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸急促、活動量下降典型的哮喘發(fā)作的癥狀為激發(fā)成功。
　　 4、BCG干預組(BCG intervention group)：所有的幼鼠于實驗

5、第1、8天對幼鼠腹腔注射OVA100mg和氫氧化鋁100mg（混于9g/L生理鹽水2mL中）進行致敏，于激發(fā)前7d(第8天)給予皮內注射BCG0.025mg，第15天開始每日激發(fā)前30min給予皮內注射BCG,劑量同上。
　　 最后一次激發(fā)24小時后，1％戊巴比妥鈉麻醉動物、取材。動物肺功能檢查（檢測氣道基本阻力和靜脈注射乙酰膽堿后氣道阻力變化）；肺組織行病理切片，HE染色，采用計算機圖象分析技術測定支氣管基底膜周徑(Pbm)，

6、總管壁面積(WAt)，平滑肌面積(WAm)等反映氣道壁厚度的指標；ELISA法檢測各組大鼠血清中IFN-γ，IL-4含量的變化；免疫組織化學法檢測各組大鼠氣道壁CyclinD1、α-SMA的表達變化，并應用圖像分析軟件測量CyclinD1、α-SMA的相對表達強度。
　　 結果：
　　 1、各組大鼠肺功能的檢測：氣道激發(fā)試驗檢測呼吸峰值的變化間接反應氣道阻力（兩者成反比）結果顯示：鹽水激發(fā)(13.02±2.44，10.7

7、1±2.47，13.15±1.47，12.43±2.00，F(xiàn)=2.204，P＞0.1)和6.25μg/ml乙酰膽堿激發(fā)(11.62±0.80，11.16±0.91，11.38±1.03，10.63±1.19，F(xiàn)=1.453，P＞0.1)時各組間呼吸峰值的變化無明顯差異；隨著乙酰膽堿濃度的增加，哮喘模型組(8.79±1.31，6.47±1.62，4.55±1.03)呼吸峰值較正常組(12.36±1.35，12.36±1.59，11.80±

8、1.97)明顯減低；多BCG組(10.61±0.83，10.70±1.24，0.41±0.93)、干預組(10.47±1.77，9.50±1.04，9.65±1.20)呼吸峰值較正常對照組減低，但減低程度較哮喘模型組低。
　　 2、各組大鼠血清IL-4、IFN-γ的檢測：哮喘組(33.98±2.35)ng/L和多BCG組(16.46±1.92)ng/L、干預組(20.89±2.29)ng/L血清IL-4水平比正常組(11.43±

9、2.72)ng/L顯著升高，有顯著性差異；多BCG組和干預組IL-4水平較哮喘組明顯減低，且有統(tǒng)計學差異，且多BCG組與干預組之間有顯著性差異，多BCG組優(yōu)于干預組。哮喘組(10.9±1.9)ng/L和多BCG組(22.7±2.1)ng/L、干預組(18.5±1.5)ng/L血清IFN-γ水平比正常組(30.4±3.6)ng/L顯著減低，有顯著性差異；且各組之間均有顯著性差異，多BCG組優(yōu)于干預組。
　　 3、肺泡灌洗液細胞計數(shù)

10、及分類與正常對照組(5.40±1.52)×106細胞總數(shù)的表達相比，哮喘模型組(17.15±3.02)×106、多BCG組(8.78±2.00)×106，干預組(11.87±2.31×106的數(shù)量明顯增加，有顯著性差異；多BCG組和干預組較哮喘組數(shù)量減低，且有統(tǒng)計學意義，且多BCG組明顯優(yōu)于干預組。與正常對照組(0.51±0.18)×106嗜酸性粒細胞的數(shù)量相比，哮喘模型組(2.19±0.30)×106、多BCG組(1.19±0.31)

11、×106，干預組(1.49±0.30)×106的比例明顯增加，有顯著性差異；多BCG組和干預組較哮喘組表達減低，且有統(tǒng)計學意義，且多BCG組明顯優(yōu)于干預組。
　　 4、各組大鼠氣道重塑指標的檢測：
　　 4.1各組大鼠氣道管壁厚度的檢測哮喘組大鼠肺組織可見明顯的炎性細胞浸潤，杯狀細胞增生，黏液分泌增加和平滑肌細胞增生，卡介苗干預后能明顯減少上述改變。分析比較各組大鼠氣道管壁面積、平滑肌面積結果顯示：哮喘模型組(98.17

12、±9.38、23.36±2.62)和多BCG(72.10±8.70、13.03±2.62)，干預組（80.34±9.23、18.61±2.31）氣道管壁面積、平滑肌面積顯著大于正常對照，多BCG組和干預組氣道管壁面積、平滑肌面積明顯小于哮喘模型。多BCG組優(yōu)于干預組。
　　 4.2各組大鼠氣道免疫組化CyclinD1、α-SMA的圖像半定量分析，以陽性平均灰度值為統(tǒng)計量（含量與陽性平均灰度值成反比）：α-SMA:與正常組(126

13、.3609±6.9006)（見Fig3.A）大鼠氣道α-SMA的陽性平均灰度值相比，哮喘組(99.6951±5.8131)（見Fig3.B）、多BCG組(116.6681±9.4061)（見Fig3.C）干預組(109.4332±5.0131)（見Fig3.D）的明顯減低，有顯著性差異；其中哮喘組比多BCG組和干預組表達減低，有顯著性差異，但多BCG組和干預組多BCG組與干預組之間沒有顯著性差異。
　　 CyclinD1:與正常

14、對照組(157.7±4.5079)（見Fig4．A）CyclinD1陽性目標平均灰度的表達相比，哮喘模型組(129.8±4.9666)（見Fig4.B）、多BCG組(152.2±5.0692)（見Fig4.C），干預組(148.3±2.0017)（見Fig4.，D）的陽性平均灰度值明顯減低，有顯著性差異；多BCG組和干預組較哮喘組表達增加，且有統(tǒng)計學意義，但多BCG組和干預組多BCG組與干預組之間沒有顯著性差異。
　　 5、Cy

15、clinD1與α-SMA及CyclinD1與IFN-γ和IL-4與CyclinD1的相關分析Pearson相關分析證明哮喘模型組大鼠肺組織中CyclinD1與α-SMA的表達成正相關(r=0.728，P=0.000);血清中IFN-γ與肺組織中CyclinD1含量（1/平均陽性灰度值）成負相關。血清中IL-4與肺組織中CyclinD1含量（1/平均陽性灰度值）成正相關。
　　 結論：
　　 1、哮喘模型成功建立，哮喘組大

16、鼠在實驗期間出現(xiàn)毛色無光澤、精神萎靡、反應遲鈍、體重輕于正常對照組等情況；激發(fā)過程中可見大鼠呼吸急促、煩躁不安、張口呼吸、口唇紫紺、甚至四肢癱軟的表現(xiàn)。而正常對照組大鼠在實驗過程中無異常表現(xiàn)，飲食、行動、呼吸節(jié)律、體重均正常。這為建立哮喘模型組提供依據(jù)。
　　 2、哮喘模型組各大鼠肺組織病理可見大量炎性細胞浸潤，肺泡灌洗液中細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞比例明顯高于正常對照組，血清IL-4水平明顯升高，IFN-γ水平下降，IL-4/IF

17、N-γ比例升高，且均與正常對照組有顯著性差異，提示Th2反應在哮喘發(fā)病中占主要的地位。Th1/Th2比例失衡在哮喘發(fā)病中起到重要的作用。
　　 3、多BCG組和BCG干預組大鼠肺組織病理中的炎性細胞低于哮喘模型組但高于正常對照組，肺泡灌洗液中細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞比例低于哮喘模型組但高于正常對照組，血清IL-4水平低于哮喘模型組但高于正常對照組，IFN-γ水平高于哮喘模型組但低于正常對照組，IL-4/IFN-γ比例低于哮喘模型組

18、，說明BCG可以調節(jié)Th1/Th2比例平衡，促進Th1型反應，抑制Th2型反應，減輕氣道炎癥。
　　 4、哮喘模型組氣道α-SMA和cyclinD1含量（1/陽性平均灰度值）水平明顯高于正常組且差別有統(tǒng)計學意義，說明哮喘發(fā)病初期即有氣道重塑發(fā)生。行IL-4與cyclinD1（1/陽性平均灰度值）相關分析成正相關，α-SMA與cyclinD1相關分析成正相關，推測Th2分泌IL-4，進而產(chǎn)生各種炎性介質刺激cyclinD1的表達，

19、啟動細胞周期，氣道平滑肌細胞增殖導致α-SMA表達增多。BCG干預后α-SMA和cyclinD1（1/陽性平均灰度值）水平明顯低于哮喘組，行IFN-γ與cyclinD1（1/陽性平均灰度值）相關分析成負相關，推測BCG可能通過上調Thl反應，促進IFN-γ的產(chǎn)生，而IFN-γ可抑制CDK2的活化和cyclinD1的表達，使G1后期pRb不能高磷酸化，轉錄因子E2F失去轉錄活性，氣道平滑肌細胞G1/S期轉化受阻，從而有效地抑制氣道平滑肌增