凋亡抑制蛋白livin在急性白血病中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、第一部分Livin在急性白血病的表達(dá)和臨床意義 [目的] 檢測(cè)livinmRNA在急性白血病(AL)患者和正常人中的表達(dá)情況，觀察livin在急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性非淋巴細(xì)胞性白血病(ANLL)和正常人的表達(dá)差異，并分析探討livin表達(dá)與AL的誘導(dǎo)化療完全緩解率(CR)的關(guān)系。 [方法] 隨機(jī)選擇50例符合FAB診斷標(biāo)準(zhǔn)的初發(fā)AL患者，采集其骨髓或外周血(幼稚細(xì)胞較高時(shí))單個(gè)核細(xì)胞，提取總

2、mRNA，用RT-PCR法檢測(cè)患者化療前和6例正常對(duì)照者的livinmRNA表達(dá)水平，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較livin在ALL與ANLL之間、ALL和ANLL與正常人之間表達(dá)有無顯著差異性。收集患者臨床資料，分析其誘導(dǎo)化療效果及其與livin表達(dá)的關(guān)系。 [結(jié)果] 在正常人中，1ivinmRNA表達(dá)陽性率僅為16.7％。50例AL患者中41例livinmRNA表達(dá)陽性(82.0％)。19例ALL患者中17例細(xì)胞

3、1ivinmRNA表達(dá)陽性(89.4％)。31例ANLL患者中24例livinmRNA表達(dá)陽性(77.4％)。在ALL和ANLL細(xì)胞中，1ivinmRNA表達(dá)陽性率均明顯高于正常對(duì)照組(P值均＜0.01)。Livin的表達(dá)水平與AL誘導(dǎo)化療CR率成負(fù)相關(guān)。特別在急性淋巴細(xì)胞性白血病中，1ivin表達(dá)上調(diào)的病例其誘導(dǎo)化療緩解率(CR率)較低。 [結(jié)論] Livin在多數(shù)急性白血病患者中表達(dá)上調(diào)，livin在ALL中的高表達(dá)

4、提示誘導(dǎo)緩解率較低。Livin可以作為判斷ALL預(yù)后的新指標(biāo)，并有可能成為白血病基因治療的新靶點(diǎn)。 第二部分RNA干擾技術(shù)沉默K562細(xì)胞livin基因的實(shí)驗(yàn)研究 [目的] 觀察小分子RNA干擾技術(shù)下調(diào)高表達(dá)livin的白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞livin基因表達(dá)后，K562細(xì)胞的自發(fā)凋亡率及K562細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化，并初步探討其誘導(dǎo)凋亡和增加藥物敏感性的分子機(jī)制。 [方法] K562細(xì)胞

5、常規(guī)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期；根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)三條針對(duì)livin基因的特異干擾序列；化學(xué)合成livin基因siRNA及陰性對(duì)照(si-neg)，核轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞；通過RT-PCR分析轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞livinmRNA的表達(dá)情況；通過WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞livin蛋白的表達(dá)；利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的分析，觀察轉(zhuǎn)染及藥物VP-16對(duì)K562的誘導(dǎo)凋亡作用；MTT法檢測(cè)K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后對(duì)V

6、P-16的敏感性變化；利用酶標(biāo)儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞Caspase-3的活性變化。 [結(jié)果] ①三條siRNA都能在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)livinmRNA的表達(dá)，并進(jìn)而降低livin蛋白的表達(dá)水平；其中以第三條序列的基因沉默效果最明顯。②以siRNA-3為轉(zhuǎn)染序列，K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí)自發(fā)凋亡率為27.41±0.31％，與未轉(zhuǎn)染組的9.63±0.08％相比，有明顯提高(P＜0.05)；未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染組，單加VP-16

7、組，VP-16和轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組48小時(shí)的凋亡率分別為9.6±0.11％、27.7±0.30％、31.4±0.29％、45.1±0.40％；③轉(zhuǎn)染siRNA-3后，VP-16對(duì)K562細(xì)胞的半數(shù)致死量(IC50)由轉(zhuǎn)染前的10μmol/L下降至5μmol/L④Caspase-3的活性在轉(zhuǎn)染siRNA-3前后分別為100％和145％。 [結(jié)論] RNA干擾技術(shù)可以在mRNA水平下調(diào)K562細(xì)胞livin基因表達(dá)，進(jìn)而影響蛋白