急性白血病中survivin的表達及構(gòu)建其真核表達載體并轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞.pdf

1、研究背景： 白血病是青壯年及兒童最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率逐年上升。近20余年來,隨著聯(lián)合化療、造血干細(xì)胞移植等技術(shù)的不斷推廣應(yīng)用,白血病的5年生存率大大提高,但是由于白血病細(xì)胞的免疫逃逸,使許多患者仍然難逃復(fù)發(fā)的厄運。造成免疫逃逸的重要原因是白血病細(xì)胞的免疫原性低或缺乏特異性抗原。因此,近年來各種以基因治療為主的生物學(xué)治療成為白血病治療的一種新的、可行的手段。 Survivin是凋亡抑制蛋白(LAP)家族新成員之一,

2、它在細(xì)胞存活、維持細(xì)胞有絲分裂的正常進行所起的關(guān)鍵作用以及選擇性在腫瘤組織中表達的特性,使之成為白血病免疫治療的一個新的靶點?，F(xiàn)階段國際上腫瘤疫苗的研究熱點集中于重組基因疫苗和融合細(xì)胞疫苗,如何提高疫苗的效價是腫瘤疫苗最終能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。Survivin在細(xì)胞存活、維持細(xì)胞有絲分裂方面起到關(guān)鍵作用而且在腫瘤組織中選擇表達,B7-1是抗原呈遞細(xì)胞表面與T細(xì)胞協(xié)同刺激分子CD28和CTLA-4相互作用的配體,可促進多種抗原誘導(dǎo)的免疫反

3、應(yīng)。將穩(wěn)定表達survivin/B7-1的K562細(xì)胞系,與DC細(xì)胞融合以觀察其對腫瘤的免疫防治效果,因而以細(xì)胞融合法制備腫瘤疫苗可有效的增強對survivin及其他腫瘤抗原的提呈,增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng),它在腫瘤的防治方面會有良好的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)外關(guān)于survivin/B7-1轉(zhuǎn)基因修飾的白血病疫苗的研究尚屬空白。 本試驗在進一步明確survivin在白血病細(xì)胞表達情況的基礎(chǔ)上,構(gòu)建含有人survivin基因的表達質(zhì)粒并

4、轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞,為后續(xù)建立穩(wěn)定表達survivin/B7-1的K562細(xì)胞系及白血病的靶向治療研究做準(zhǔn)備。 實驗方法： 第一部分：收集64例符合FAB-MICM診斷標(biāo)準(zhǔn)的急性白血病患者骨髓液標(biāo)本,Trizol提取細(xì)胞總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測標(biāo)本中survivin mRNA表達,并進行半定量分析。 第二部分：在GeneBank中確定所需基因的序列號為BC065497,將含有該基因的

5、載體質(zhì)粒經(jīng)PCR方法擴增后,基因測序鑒定所獲基因序列的正確性。將擴增產(chǎn)物連接至T載體,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆菌株過夜培養(yǎng)。小量提取質(zhì)粒進行EcoRI和BamHI雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳后回收產(chǎn)物連接至帶有綠色熒光的plRES2-EGFP載體(Bam HFEcoR I雙酶切),將最終產(chǎn)物命名為plRES2-EGFP-Survivin。常規(guī)培養(yǎng)K562細(xì)胞,取其對數(shù)生長期,用SuperFect轉(zhuǎn)染液將plRES2-EGFP-S

6、urvivin轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞,觀察24h、48h及72h時段熒光表達。并采用RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后相應(yīng)時間點K562細(xì)胞中survivin mRNA表達量。 結(jié)果： 1.急性白血病患者survivin mRNA表達陽性率與正常對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。急性白血病患者survivin mRNA表達水平與正常對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。2.急性白血病初治組、復(fù)發(fā)組及緩解組陽性表達率和表達量與正常

7、對照組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),初治組和復(fù)發(fā)組與緩解組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),但初治組和復(fù)發(fā)組兩組間陽性表達率和表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。各FAB-MICM分型由于例數(shù)限制,未進行亞型間統(tǒng)計。3.獲得正確的人全長survivin序列。4.成功構(gòu)建人全長survivin真核表達質(zhì)粒plRES2-EGFP-Survivin。5.成功將pIRES2-EGFP-Survivin轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞。6.檢測到轉(zhuǎn)染后

8、的K562細(xì)胞中survivin mRNA表達量較轉(zhuǎn)染前增加。 結(jié)論： 1.急性白血病患者survivin mRNA的表達陽性率高于正常對照組,這與文獻報道-致,且其表達量在初發(fā)、復(fù)發(fā)及緩解時都較正常對照高,這些都提示survivin表達紊亂可能在急性白血病的發(fā)病過程中起重要作用,且有可能成為治療及預(yù)后的指標(biāo)之一。 2.目前國內(nèi)外關(guān)于Survivin/B7-1轉(zhuǎn)基因修飾的白血病疫苗的研究尚屬空白,導(dǎo)入surviv