構(gòu)建TGF-β1siRNA真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞的初步研究.pdf

1、背景：肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是由多種因素引起的一組肺間質(zhì)彌漫性疾病,是異質(zhì)性疾病,也是多種肺疾病的共同結(jié)局,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及到各種蛋白酶、膠原、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、自由基損傷及細(xì)胞凋亡等因素間的相互作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是公認(rèn)的肺間質(zhì)纖維化形成和發(fā)展中的“開關(guān)性”細(xì)胞因子,作為一種多功能及強(qiáng)效的致纖維化因子,其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的很多環(huán)節(jié)起作用,參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖及細(xì)胞外

2、基質(zhì)分泌,是纖維化發(fā)生過程中最直接的一種細(xì)胞因子。因而基于TGF-β1機(jī)制的特異性抗肺纖維化治療方法在肺纖維化治療方面具有廣闊前景,通過對TGF-β1引起肺間質(zhì)纖維化的研究,為我們發(fā)展新的治療策略提供了重要信息,提示發(fā)展藥物分子靶,集中在一些與發(fā)病密切相關(guān)的靶向上(如TGFβ1),可以作為未來治療肺間質(zhì)纖維化的重要靶點。
　　RNA干擾(RNA interference,RNAi)是新近出現(xiàn)的一種分子生物學(xué)技術(shù),它通過導(dǎo)入由對應(yīng)的

3、正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA),誘導(dǎo)受體細(xì)胞中與其有同源序列的特異性靶mRNA降解,阻止蛋白質(zhì)的翻譯過程,從而使得相應(yīng)的同源基因沉默。RNAi廣泛存在于生物界中,從低等原核生物到植物、真菌和無脊椎動物,甚至在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象,只是機(jī)制也就更為復(fù)雜。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn),干擾性小RNA(small interfering RNA或short interferingR

4、NAs,siRNA)是RNA干擾賴以發(fā)生的一種重要中間效應(yīng)分子,利用小分子物質(zhì)來特異性沉默基因的表達(dá)是一種有效治療手段,很多研究正在利用這些小分子物質(zhì)的特殊作用來創(chuàng)造出新的治療性藥物,siRNAs極大可能成為這類藥物中的新成員。siRNA和RNA干擾技術(shù)的研究和應(yīng)用,具有非常重要的理論和實際意義。
　　目的：根據(jù)大鼠TGF-β1mRNA序列,構(gòu)建具有特異性阻斷大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)基因的TGF-β1siRNA-pSi

5、lencerTM2.0-U6真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞(人A549肺癌細(xì)胞),觀察其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,為利用基因沉默技術(shù)從轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行肺間質(zhì)纖維化治療的研究做準(zhǔn)備。
　　材料與方法：1.應(yīng)用siRNA設(shè)計軟件,根據(jù)大鼠TGF-β1mRNA序列設(shè)計針對其339和1965位點的兩對TGF-β1 siRNA靶序列,體外分別合成兩對小發(fā)卡RNA(shorthairpin RNA,shRNA)結(jié)構(gòu)的DNA序列,退火形成雙鏈后克隆進(jìn)

6、入pSilencerTM2.0-U6表達(dá)載體,對重組體進(jìn)行酶切鑒定,并送上海生物工程公司進(jìn)行行序列分析。2.鑒定正確后,提取重組表達(dá)載體TGF-β1siRNA-pSilencerTM2.0-U6,應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞(人A549肺癌細(xì)胞),在熒光顯微鏡下觀察其在真核細(xì)胞中表達(dá)情況。3.以空白及空質(zhì)粒組(未克隆入TGF-β1 siRNA的pSilencerTM2.0-U6質(zhì)粒)做為對照,提取轉(zhuǎn)染有重組表達(dá)載體TGF-β1 siRNA

7、-pSilencerTM2.0-U6的真核細(xì)胞內(nèi)總mRNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測人A549肺癌細(xì)胞中TGF-β1mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.確定TGF-β1mRNA339和1965位點的2個編碼序列,分別為5’-GTACTTCACCAACTGCAAG-3’和5’-AAACAATGTGGTGAGT GTC-3’,根據(jù)以上靶序列體外成功設(shè)計并合成編碼短發(fā)夾RNA(shRNA)序列的DNA單鏈。2.對重組質(zhì)粒

8、酶切鑒定,得到兩端含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的位于2000bp附近的線性pSilencerTM2.0-U6載體基因片段,和位于100bp附近的發(fā)夾樣siRNA目的基因,理論與實驗結(jié)果相符。3.重組質(zhì)粒送生物工程公司進(jìn)行T4單向測序,結(jié)果表明,克隆入真核表達(dá)載體pSilencerTM2.0-U6的TGF-β1siRNA序列與設(shè)計完全符合。4.轉(zhuǎn)染人A549肺癌細(xì)胞后實驗組與對照組相比,TGF-β1siRNA能明顯下調(diào)TGF-β1m

9、RNA的表達(dá)(P<0.01),以339位點的TGF-β1-siRNA沉默效率最為顯著(P<0.05),對照組TGF-β1mRNA表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論：1.根據(jù)大鼠TGF-β1mRNA序列設(shè)計出針對其的發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸片段。2.成功構(gòu)建TGF-β1 siRNA-pSilencerTM2.0-U6真核表達(dá)載體。3.通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞,成功篩選出能高效抑制TGF-β1表達(dá)的339 siRNA,為下一步利用RN