攜siRNA真核表達載體靶向脂質(zhì)微泡的構(gòu)建與表征.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建沉默人survivin基因的siRNA真核表達載體,采用聚乙烯亞胺膽固醇衍生物將載體連接到脂質(zhì)微泡,并對微泡進行靶向修飾,使其與乳腺癌細胞膜表面HER-2抗原特異性結(jié)合,探索一種新型的乳腺癌RNA干擾治療基因轉(zhuǎn)染工具。
　　方法:
　　1.采用免疫熒光法檢測乳腺癌細胞膜表面HER-2抗原;采用機械振蕩法制備脂質(zhì)微泡,生物素-親和素橋接法將靶向乳腺癌細胞膜表面抗原HER-2抗體赫賽汀連接到脂質(zhì)微泡上,觀察

2、微泡的形態(tài)、密度、粒徑及分布范圍,并考察其與表達HER-2的乳腺癌細胞SK-BR-3特異性結(jié)合的能力。
　　2.設(shè)計合成靶向人survivin基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA模板,克隆至真核表達載體pGPU6/GFP/Neo,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-survivin,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TOP10菌株,擴增并提取質(zhì)粒,對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定、序列測定。
　　3.以聚乙烯亞胺、膽固醇甲酰氯為原料合成陽離子脂質(zhì)PEI-Cho

3、l,瓊脂糖凝膠電泳阻滯試驗檢測不同N/P比對PEI-Chol結(jié)合質(zhì)粒DNA能力及PEI-Chol/DNA復(fù)合物抗核酸酶DNase I酶解的能力。
　　4.采用反相蒸發(fā)-機械振蕩法制備載siRNA真核表達載體的脂質(zhì)微泡,生物素-親和素橋接法將赫賽汀抗體偶聯(lián)到脂質(zhì)微泡,構(gòu)建攜siRNA真核表達載體的靶向微泡,顯微鏡觀察微泡的形態(tài)、密度、粒徑及分布范圍,觀察載基因靶向微泡與乳腺癌細胞SK-BR-3的結(jié)合能力。
　　結(jié)果:
　

4、　1.免疫熒光結(jié)果顯示,SK-BR-3細胞可與赫賽汀結(jié)合發(fā)出綠色熒光,而MDA-MB-231未見熒光;采用機械振蕩法制備的脂質(zhì)微泡分散良好,粒徑分布較均勻,平均粒徑為(3.1±0.7)μm,密度為1.6×108/ml,生物素-親和素橋接法成功將赫賽汀偶聯(lián)到脂質(zhì)微泡;靶向脂質(zhì)微泡微泡特異性結(jié)合到表達HER-2的SK-BR-3細胞。
　　2.靶向survivin的siRNA成功克隆到pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒載體,重組載體可被限制

5、性內(nèi)切酶BamHI切開,而不能被BbsI切開,基因測序證實為survivin siRNA的真核表達載體。
　　3.當N/P為3.75時,質(zhì)粒DNA完全被PEI-Chol及PEI包裹;當N/P比降為1.88時,泳道上可見游離DNA條帶熒光,且PEI-Chol對質(zhì)粒DNA的包裹能力高于PEI。PEI-Chol包裹質(zhì)粒DNA可保護DNA免受核酸酶DNase I降解。
　　4.反相蒸發(fā)-機械振蕩法制備的載siRNA真核表達載體的脂質(zhì)