攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡的制備、表征及抗血管生成初步研究.pdf

1、目的：用生物素-親和素橋接法制備攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡，并考察其相關(guān)性能，初步探討其抗血管生成作用。
　　方法：1.采用機(jī)械振蕩法制備脂質(zhì)微泡，生物素-親和素橋接法將重組人血管內(nèi)皮抑制素連接到脂質(zhì)微泡上；光學(xué)顯微鏡觀察載藥微泡的形態(tài)、粒徑及分布，熒光顯微鏡鑒定，ELISA檢測(cè)微泡載藥量；
　　2.建立小鼠肝癌H22皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為載藥微泡組與SonoVue組進(jìn)行超聲造影，對(duì)比載藥微泡與SonoVue的造影效果

2、及造影參數(shù)差異；
　　3.采用灌注消化法原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，免疫組化法鑒定HUVEC細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)情況；
　　4. MTT法檢測(cè)重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)HUVEC增殖的抑制作用；
　　5.體外培養(yǎng)HUVEC，分為重組人血管內(nèi)皮抑制素組、重組人血管內(nèi)皮抑制素+超聲輻照組、載藥微泡+超聲輻照組，分別于處理后1h、2h裂解細(xì)胞，ELISA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)rh-ES含量，觀察不同處理對(duì)細(xì)胞攝取藥物的影響；
　　6.

3、雞胚隨機(jī)分成7組：重組人血管內(nèi)皮抑制素組低、中、高劑量組、單純載藥微泡組、重組人血管內(nèi)皮抑制素+超聲輻照組、載藥微泡+超聲輻照組、生理鹽水對(duì)照組，處理48h后分析尿囊膜血管生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果：1.采用生物素-親和素橋接法成功制備了攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡，微泡密度約（5.2±0.1）×108/mL，平均粒徑為(3.0±0.4)μm，不低于82.4％的微泡直徑在2～7μm范圍內(nèi)；ELISA測(cè)得每108微泡載藥量為（800±7

4、0.53）μg。
　　2.小鼠尾靜脈團(tuán)注微泡造影劑后，腫瘤從周邊開(kāi)始增強(qiáng)，繼而向腫瘤內(nèi)部充填式快速?gòu)?qiáng)化，并迅速消退。載藥微泡和SonoVue超聲造影表現(xiàn)相似，二者的超聲造影參數(shù)AT、TTP及PBD差異無(wú)顯著性意義（P>0.05）。
　　3.原代培養(yǎng)HUVEC單層生長(zhǎng)，呈多角形或短梭形，絕大部分細(xì)胞胞漿表達(dá)Ⅷ因子。
　　4.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，同一濃度的rh-ES對(duì)HUVEC作用24 h、48 h、72 h后，隨著作用時(shí)

5、間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)，在400ng/mL劑量范圍內(nèi)，呈現(xiàn)一定的劑量-時(shí)間依賴關(guān)系。
　　5.載藥微泡+超聲輻照作用1h、2h細(xì)胞內(nèi)藥物量分別為(5.58±0.16)ng/mg總蛋白、(6.45±0.11)ng/mg總蛋白，均明顯高于rh-ES組的(1.75±0.15)ng/mg總蛋白、(2.15±0.18)ng/mg總蛋白及rh-ES+US組的(2.31±0.28)ng/mg總蛋白、(2.50±0.19)ng/mg總蛋白（

6、P<0.05）。
　　6.生理鹽水對(duì)照組CAM血管生長(zhǎng)良好，呈放射狀均勻分布；各處理組給藥處新生血管量均較對(duì)照組減少，尤其是RHEM+US組，新生血管面積為（6.73±3.25）cm2，新生血管面積/CAM面積比為（13.12±5.87）%，均明顯低于其他各組（P<0.05）。
　　結(jié)論：采用生物素-親和素橋接法制備的攜重組人血管內(nèi)皮抑制素脂質(zhì)微泡粒徑適宜、分布均勻，載藥量高；聯(lián)合超聲輻照可促進(jìn)藥物進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，具有明