超聲輻照載諾帝脂質(zhì)微泡對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的:
　　 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的重要原因之一,而腫瘤血管生成則是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。因此,抗血管生成治療成為目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。靶向給藥系統(tǒng)能將藥物定向輸送到治療部位,提高治療部位的藥物濃度,減少藥物用量,降低不良反應(yīng),提高了藥物的安全性和有效性。在超聲作用下,含有氣體的脂質(zhì)微泡產(chǎn)生空化作用,微泡發(fā)生內(nèi)爆產(chǎn)生的能量可引起聲孔效應(yīng),即大分子可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞并被細(xì)胞俘獲。這種利用脂質(zhì)微泡作為遞送

2、載體的方法具有高效、無創(chuàng)、無免疫源性等優(yōu)點(diǎn),因此,近年來脂質(zhì)微泡成為一種靶向給藥的新途徑。諾帝(Nordy)是一種基于天然脂氧化酶抑制劑去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acid,NDGA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)而合成的手性化合物。近年的研究證實(shí)NDGA在體內(nèi)外均具有抑制血管生成和人多種腫瘤的效應(yīng)。本研究擬制備一種包載諾帝的脂質(zhì)體微泡造影劑,研究超聲介導(dǎo)載諾帝脂質(zhì)微泡對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法:

3、　　 (1)采用機(jī)械振蕩法制備攜載諾帝脂質(zhì)微泡造影劑,在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)和大小,使用Malvern激光粒徑測(cè)量?jī)x和Malveto表面電位檢測(cè)儀檢測(cè)其粒徑和表面電位,應(yīng)用高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測(cè)包封率,使用Sequoia512型彩色多普勒超聲儀,對(duì)比脈沖序列(contrast pulse sequencing,CPS)成像技術(shù)觀察其在兔肝內(nèi)顯像;(2)采用胰酶灌注法消化獲取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng);(3)通過MT

4、T比色法、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)選擇超聲破壞脂質(zhì)微泡對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作用的相關(guān)參數(shù);(4)采用血管內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的方法觀察超聲輻照載諾帝脂質(zhì)微泡對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞體外形成小管樣結(jié)構(gòu)的影響;(5)采用人肺腺癌細(xì)胞株(A549細(xì)胞)上清液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.Hy926)的方法,觀察超聲輻照載諾帝脂質(zhì)微泡對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞的影響,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTI-PCR)的方法觀察其腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物8(tumorendothelia

5、l marker8,TEM8)表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 (1)載藥脂質(zhì)微泡的濃度為(2.53±0.52)×109個(gè)/ml,粒徑為(2.61±0.32)μm,Zeta電位為+(17.52±2.04)mV;載諾帝脂質(zhì)微泡的包封率(27.1±2.01)％,載藥量為(10.9±0.90)％;微泡經(jīng)外周靜脈注射后,兔肝可見良好、持續(xù)的增強(qiáng)顯像效果。(2)采用胰酶灌注法原代培養(yǎng)HUVEC,經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒定證實(shí)為HUV

6、EC。(3)當(dāng)諾帝濃度為50μmol/L,100μmol/L,150μmol/L,200μmol/L時(shí),細(xì)胞在24 h的增殖抑制呈劑量效應(yīng)關(guān)系。頻率為1.5 MHz,機(jī)械指數(shù)(mechanical index,MI)1.9,時(shí)間60 s、90 s、120 s、150 s超聲破壞諾帝微泡,在120 s時(shí)細(xì)胞膜對(duì)大分子的臺(tái)盼藍(lán)染料暫時(shí)性開放,染料進(jìn)入細(xì)胞并被細(xì)胞俘獲。(4)比較空白組、單純諾帝微泡組、諾帝溶液組、超聲輻照諾帝溶液組、超聲輻照

7、載諾帝脂質(zhì)微泡組對(duì)管腔結(jié)構(gòu)形成抑制情況。與其他各組相比,超聲輻照載諾帝脂質(zhì)微泡組抑制作用更加顯著。(5)經(jīng)誘導(dǎo)后的EA.Hy926細(xì)胞具有腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(Td-EC)的特征。超聲輻照載諾帝微泡可以使Td-EC表達(dá)。TEM8減少。
　　 結(jié)論:
　　 (1)采用機(jī)械振蕩法制備的載諾帝脂質(zhì)微泡,能夠通過肺血管床,符合外周靜脈注射要求,可以作為體內(nèi)遞送諾帝的一種方式。(2)載諾帝脂質(zhì)微泡可以顯著抑制體外管腔結(jié)構(gòu)的形成。(3)