重組人血管內(nèi)皮抑素的抗腫瘤血管生成作用及其對順鉑治療肺癌效果的影響.pdf

1、原發(fā)性支氣管肺癌(primary bronchogenic carcinoma)的發(fā)病率及致死率有逐年上升的趨勢，對肺癌發(fā)病相關因素及提高治療效果的深入探究，以期早期發(fā)現(xiàn)，準確診斷、良好治療，一直是研究者追求的目標。近年來不少研究表明，惡性腫瘤的生長、轉移呈血管依賴性，新生血管不但為惡性腫瘤的生長提供了充足的養(yǎng)分、排泄代謝廢物，還為腫瘤細胞的轉移提供了良好的通道。腫瘤血管的生成在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移及復發(fā)中，起著重要作用。因

2、此抗血管生成治療聯(lián)合細胞毒藥物有望提高惡性腫瘤治療的效果。重組人血管內(nèi)皮抑素（重組人血管內(nèi)皮抑素）是由我國自行研制生產(chǎn)的抗血管生成藥物。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor1 alpha，HIF-1α)、信號素3A(Semaphorin3A，Sema3A)、CD105(endoslin，EDG)參與了腫瘤血

3、管生成及發(fā)展的過程，在惡性腫瘤的生物學行為中起重要作用。本實驗則通過動態(tài)對比觀察不同組別Lewis肺癌移植瘤小鼠的體重、腫瘤體積及血管生成相關因子VEGF、HIF-1α、Sema3A、CD105表達的變化，及腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞及血管形態(tài)的變化來證實重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合順鉑能提高治療效果，并闡述可能的機制，從而為重組人血管內(nèi)皮抑素廣泛應用于臨床以及研究肺癌血管正?；赡艿陌l(fā)生機制提供實驗基礎。實驗主要由以下幾部分組成:
　　1.動

4、物模型的建立、分組及給藥方法
　　培養(yǎng)小鼠Lewis肺癌細胞，接種于C57BL/6小鼠右腋下建立移植瘤模型，接種Lewis肺癌細胞后8-10天，荷瘤鼠接種處皮下可觸到黃豆大小腫塊，并隨時間延長逐漸增大。2周后挑選56只腫瘤直徑8mm左右荷瘤鼠，隨機分為4組:A組:生理鹽水組:B組:重組人血管內(nèi)皮抑素組;C組:順鉑組;D:重組人血管內(nèi)皮抑素+順鉑組。每次給藥前根據(jù)測量的體重調(diào)整給藥量。在給藥后第2d、4d、6d、8d、10d、12d

5、、14d每組各處死2只小鼠，取出腫瘤組織，固定。
　　2.給藥后小鼠一般情況的觀察
　　以A組小鼠的一般情況為標準，隨給藥時間的延長，B組小鼠飲食、活動情況基本正常，體重及腫瘤體積較A組增長緩慢。C組小鼠逐漸出現(xiàn)精神差，飲食及活動量明顯減少，毛色灰暗無光澤，蜷縮扎堆，體重下降最明顯，瘤體積較B組為小。D組小鼠一般情況較C組為好，但差于B組，體重較C組為高，瘤體積小于C組。
　　3.腫瘤組織的病理觀察
　　大體觀察

6、:腫瘤血管豐富，質(zhì)脆，易出血，腫瘤細胞浸潤周圍組織及皮膚，界限不清，不易剝離，出血明顯，切面呈魚肉狀，中間有壞死區(qū)。HE染色光鏡下觀察:癌細胞數(shù)量大，細胞排列緊密，細胞體積大，核大，間質(zhì)血管豐富。
　　4.腫瘤血管生成相關因子表達的觀察
　　待腫瘤組織全部取出后，免疫組織化學方法觀察促血管生成的相關因子VEGF、HIF-1α，以及抑制血管生成因子Sema3A的表達。結果顯示:四組均可見VEGF的陽性表達，A組表達最高(153

7、.67±5.40)，D組表達最低(78.79±7.83)。HIF-1α亦在四組中呈陽性表達，A組表達最高(142.10±4.18)，D組表達最低(60.05±9.70)。兩者均在化療開始后B組和D組第2天表達最高，第4-8天表達最低，第9-14天表達強度逐漸升高，但比第2天表達低。Sema3A在A組及C組未見其表達，D組表達最高(75.48±15.77)，B組(66.65±10.64)?；熼_始后第2天未見表達，第4-8天表達較高，第9

8、-14天表達強度逐漸下降。
　　5.腫瘤組織內(nèi)血管密度檢測
　　免疫組織化學方法檢測CD105，光鏡下觀察腫瘤組織內(nèi)血管，最后參照Weidner法進行微血管密度(microvessel density, MVD)的計數(shù)，取5個高倍視野的平均值，顯示:A組20.00±3.45，D組16.49±7.26。并且其表達差異與給藥后不同時間點有關，在第2天表達最高，第4-8天表達最低，第9-14天表達強度逐漸升高。
　　6.電鏡

9、下腫瘤細胞及血管結構的觀察
　　電鏡下，各組中腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞相似，胞內(nèi)核仁大，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器發(fā)達。血管結構表現(xiàn)無明顯差別，血管內(nèi)皮細胞腫脹，細胞內(nèi)細胞器發(fā)達。
　　綜上所述，Lewis肺癌細胞接種于C57BL/6小鼠后2周左右，可全部成瘤，為做小鼠肺癌移植瘤實驗提供可用途徑。通過觀察小鼠一般情況、體重、體積的變化，血管生成相關因子及微血管密度的表達情況，說明重組人血管內(nèi)皮抑素既能抗血管生成，又能提高順鉑

10、治療腫瘤的效果，機制可能為重組人血管內(nèi)皮抑素通過使腫瘤血管出現(xiàn)正常化來改善血流，進而使細胞毒藥物能更好的作用于腫瘤組織內(nèi)。但是電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，各組不同時間點腫瘤組織內(nèi)血管形態(tài)未見明顯變化，原因可能為重組人血管內(nèi)皮抑素導致血管正?；赡転檠芯空叩睦碚撏茢啵蛘哂盟帟r間短，尚不能引起形態(tài)學的變化。Sema3A為抑制腫瘤血管生成因子，研制成為制劑可能為臨床治療腫瘤血管生成提供新途徑，CD105表達于增殖的血管內(nèi)皮細胞，研制抗CD105制劑同樣可