重組人血管抑素的制備及其作用特異性的研究.pdf

1、目的：制備具有滿足臨床應用所需純度和生物學活性的重組人血管抑素(rhAS)，并研究其對血管內皮細胞作用的特異性。 方法：轉化pQE30(Angiostatin)至大腸桿菌E.Coli(M15)得到表達rhAS的基因工程菌(E.ColiM15/pQE/AS)，并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化；對rhAS包涵體純化、變性復性等條件進行優(yōu)化研究并鑒定其純度；制備得到的rhAS在人微血管內皮細胞(HMEC-1)、雞胚尿囊膜(CAM)及荷人胰腺癌裸

2、鼠模型上進行其生物學活性及體內藥效學評價；建立測定人血漿血管抑素的ELISA方法并進行初步應用；采用流式細胞術(FCM)、rhAS-Sepharose4B親和層析、99Tcm標記顯像、放射自顯影及組織形態(tài)學分析等技術對HMEC-1細胞、S180腫瘤和Matrigel模型等進行了rhAS的受體及其作用特異性的系列研究。 結果：經(jīng)轉化的基因工程菌可由IPTG誘導表達rhAS，其最佳發(fā)酵條件為菌體A600nm為0.8～1.0時進行誘導

3、，加入誘導劑IPTG的終濃度為0.1mmol/L，加入誘導劑后培養(yǎng)時間為6h。rhAS包涵體純化的最佳方法為：0.2％脫氧膽酸鈉→去離子水→2mol/LGu·HCl；rhAS變性復性最佳條件為：按1∶10(w/v)加入變性緩沖液(8mol/LGu·HCl，15mmol/LDTT)，然后將Gu·HCl變性液按1∶15(v/v)加入緩沖液稀釋，再按1∶10(v/v)對含GSH(1mmol/L)：GSSG(0.1mmol/L)氧化還原對的緩沖

4、液進行透析復性。rhAS既可抑制HMEC-1細胞的增殖，也可誘導其凋亡；可明顯抑制CAM上血管的生成和有效地抑制人胰腺癌的生長。建立了可行的測定人血漿血管抑素的ELISA方法。采用rhAS-Sepharose4B親和層析法得到了一系列HMEC-1細胞上的rhAS結合蛋白，其中ATP合酶α/β亞基及Actin為AS受體。HMEC-1細胞、S180腫瘤及Matrigel模型均可特異地結合rhAS。結論：通過對基因工程菌發(fā)酵條件、rhAS包涵