基于特異性重組受體的牛IFN-γ檢測的研究.pdf

1、干擾素(interferon，IFN)是在特定誘生劑的作用下，由細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有高度生物活性的糖蛋白，在同種動物細(xì)胞上具有免疫調(diào)控和抗病毒活性。內(nèi)源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。IFN-γ定量分析技術(shù)，對免疫學(xué)基礎(chǔ)研究，以及結(jié)核桿菌和布氏桿菌等多種胞內(nèi)病原感染的診斷，具有高度特異、敏感的突出優(yōu)勢，應(yīng)用前景廣闊。 本實驗中首先構(gòu)建了牛IFN-γ受體含信號肽胞外區(qū)片段的真核表達(dá)質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染哺乳動物

2、細(xì)胞293T細(xì)胞，以重組桿狀病毒表達(dá)牛的IFN-γ為配體，包被ELISA板進(jìn)行親和能力檢測，結(jié)果證明，哺乳動物細(xì)胞重組表達(dá)牛IFN-γ受體片段表達(dá)產(chǎn)物能夠分泌到細(xì)胞上清中，并與牛的IFN-γ具有良好的親和反應(yīng)能力。進(jìn)一步構(gòu)建了分別表達(dá)牛IFN-γ受體胞外區(qū)片段和跨膜-胞內(nèi)區(qū)片段的原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE和Western-blotting證實目的蛋白分別獲得成功表達(dá)。表達(dá)的受體蛋白經(jīng)過Glutat

3、hioneSepharose4B親和層析獲得純化。在此基礎(chǔ)上，利用純化的重組表達(dá)牛IFN-γ受體胞外區(qū)片段和跨膜-胞內(nèi)區(qū)片段替代傳統(tǒng)的雙夾心ELISA技術(shù)中的包被抗體(單抗)，建立了牛IFN-γ干擾素的雙夾心ELISA定量檢測方法，并對有關(guān)反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。重組受體與其他多種細(xì)胞因子反應(yīng)均為陰性，顯示出良好的特異性。使用方法檢測大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的牛IFN-γ，受體胞外區(qū)重組蛋白和跨膜-胞內(nèi)區(qū)重組蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸系

4、數(shù)分別為0.9683和0.9722，敏感性可以達(dá)到40.65ng/mL；用于檢測重組桿狀病毒表達(dá)牛IFN-γ，受體胞外區(qū)重組蛋白和跨膜-胞內(nèi)區(qū)重組蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸系數(shù)分別為0.9656和0.9820，檢測的敏感性可達(dá)10抗病毒活性單位(IU)/0.1ml。作為對照，美國ADL公司生產(chǎn)的商品化的牛IFN-γELISA檢測試劑盒檢測重組桿狀病毒表達(dá)牛IFN-γ，敏感性為80IU/0.1ml。 本研究結(jié)果表明，重組表達(dá)牛IF