重組牛IFn-λ3的制備及其與IFn-α-IFn-β-IFn-γ抗病毒活性比較研究.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是由動物細胞產(chǎn)生的，具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用的一類細胞因子。IFN分為Ⅰ型、Ⅱ型和新發(fā)現(xiàn)的Ⅲ型，Ⅲ型干擾素又稱為IFN-λs，其氨基酸水平和蛋白質(zhì)功能與Ⅰ型相近。由于IFN-λs受體組織分布特異性，IFN-λs主要在呼吸道、消化道和皮膚黏膜組織以及上皮細胞或某些腫瘤細胞發(fā)揮抗病毒作用，與IFN-α相比，能夠有效地降低毒副作用。在我國，奶牛病毒性傳染病如口蹄疫(FMD)、牛病毒性腹瀉病(BV

2、D)和牛傳染性鼻氣管炎(IBR)等可通過消化道、呼吸道傳播的疫病，至今危害仍比較嚴峻，因此牛IFN-λs成為繼IFN-α和IFN-β后，抗病毒制劑研發(fā)的一個方向。為深入研究牛IFN-λs的抗病毒活性及其機制，揭示其用于防治牛病毒病的可行性，本研究利用畢赤酵母分泌表達系統(tǒng)表達了無冗余氨基酸的重組牛IFN-λ3，同時酵母分泌表達了重組牛IFN-α和IFN-β，大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了重組牛IFN-β和IFN-γ，深入研究了各重組干擾素的抗病毒

3、活性，比較了IFN-λ3與Ⅰ型和Ⅱ型干擾素單獨或聯(lián)合應(yīng)用抗病毒活性的異同，主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.首先在畢赤酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)了無冗余氨基酸重組牛IFN-λ3的可溶性表達。參考酵母密碼子使用偏好性，同時考慮自由能和二級結(jié)構(gòu)等要素，將已知的牛IFN-λ3（boIFN-λ3）基因序列優(yōu)化成適合酵母表達的最優(yōu)序列，然后利用重疊延伸PCR技術(shù)將設(shè)計的相互重疊20bp左右的14條寡核苷酸融合，獲得boIFN-λ3基因和及其等位基因命名

4、為boIFN-λ3*(1個基因差異使得成熟肽第18位氨基酸不同)。通過酶切連接的方式，成功構(gòu)建酵母分泌表達載體pPICZαA-boIFN-λ3和pPICZαA-boIFN-λ3*。在畢赤酵母表達系統(tǒng)中通過一系列的篩選鑒定，如陽性重組酵母菌的鑒定，高表達酵母菌株的篩選，誘導表達條件的優(yōu)化等最終表達了重組boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白，表達量均可達1.2g/L，均以糖基化蛋白（23 kDa大小，占總蛋白70％左右）和非糖基化蛋白（

5、18 kDa大小，占總蛋白15％左右）2種形式表達。經(jīng)硫酸銨鹽析和陽離子交換層析獲得了純化蛋白，重組蛋白均具有良好的抗原性，同時制備了抗boIFN-λ3*多抗。在MDBK-VSV系統(tǒng)測定重組boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白的生物學效價分別為2.39±0.15×106U/mg/ml和2.15±0.40×106U/mg/ml。理化特性方面，重組蛋白均對胰酶敏感，對熱較為不敏感(63℃)，對酸堿部分敏感（pH2活性下降2倍），可被特異

6、性抗體中和。從重組蛋白的表達、純化、糖基化分析、理化特性、生物學活性和致細胞毒性等綜合分析，重組蛋白boIFN-λ3和boIFN-λ3*沒有區(qū)別。
　　 2.表達純化了重組牛IFN-α/IFN-β/IFN-γ并初步測定了它們的生物學活性。為比較重組boIFN-λ3與Ⅰ型和Ⅱ型IFN的抗病毒活性，酵母分泌表達系統(tǒng)表達了重組牛IFN-α和IFN-β，大腸桿菌系統(tǒng)表達純化了重組牛IFN-β和IFN-γ，測定它們的生物學活性分別為1.5

7、0±0.98×107、1.25±0.38×104、2.44±0.91×103和0.81±0.21×105 U/mg/ml。在MDBK-VSV系統(tǒng)中4種重組干擾素抗病毒效價大小排序為boIFN-α＞boIFN-λ3＞ boIFN-γ＞boIFN-β。在EBK和MDBK細胞上利用MTT法測定4種重組干擾素的細胞毒性，結(jié)果顯示，重組boIFN-λ3和其他IFNs單獨或聯(lián)合應(yīng)用致細胞毒性均較小。
　　 3.重組boIFN-λ3和boIF

8、N-α/boIFN-β/boIFN-γ誘導Mx1蛋白和ISRE啟動子活性的研究。經(jīng)過Western blot檢測重組boIFN-λ3在4種上皮細胞源細胞（EBK、BT、MDBK和BMEC）中均能夠誘導產(chǎn)生Mx1蛋白。采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，通過檢測ISRE報告基因的表達水平來間接反映干擾素的生物活性。結(jié)果顯示不同濃度的重組IFNs誘導啟動子表達均呈一定程度的劑量依賴性，重組boIFN-λ3和boIFN-γ誘導報告基因的表達水平呈時間

9、依賴性，48h達到較高水平;而boIFN-α和boIFN-β能夠快速的誘導報告基因表達，干擾素作用12h即達到較高的水平，且維持到48h。聯(lián)合應(yīng)用時部分組合比單獨應(yīng)用時誘導ISRE活性高。因此各IFNs刺激產(chǎn)生的ISRE啟動子活性的差異可能是重組boIFN-λ3與其他IFNs協(xié)同抗病毒活性的機理之一。
　　 4.比較研究了重組boIFN-λ3和重組boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ抗IBRV、FMDV和BVDV的研究

10、。通過TCID50法測定抗IBRV和FMDV活性，抗cpBVDV采用噬斑減數(shù)法，抗ncpBVDV采用半定量RT-PCR法。結(jié)果顯示重組boIFN-λ3和其他3種重組IFNs均具有抗IBRV和FMDV的活性，且呈一定程度的劑量和時間依賴性。其中抗FMDV活性較強，抗IBRV活性較弱。重組boIFN-λ3可條件性的抑制cpBVDV和ncpBVDV的增殖，即在先孵育干擾素后感染病毒時，重組boIFN-λ3可抑制BVDV增殖，反之則沒有作用。<

11、br>　　 5.重組boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ協(xié)同抗病毒的研究。通過測定干擾素作用后的病毒-細胞混懸液的TCID50，結(jié)果顯示重組boIFN-λ3抗IBRV時和boIFN-γ協(xié)同作用強，抗FMDV時，boIFN-λ3在EBK和BT細胞上均顯示出和boIFN-α/boIFN-β明顯的協(xié)同作用，提示在臨床應(yīng)用時可以聯(lián)合應(yīng)用重組boIFN-λ3和其他干擾素。推測協(xié)同機制可能與ISRE啟動子活化水平及干擾

12、素刺激基因(ISGs)的表達等有關(guān)。
　　 6.ncpBVDV持續(xù)性細胞感染是否影響重組boIFN-λ3抗病毒活性的研究。ncpBVDV(HLJ-11)感染MDBK細胞后在不同濃度重組boIFN-λ3和重組boIFN-α壓力篩選下傳代8次，通過半定量RT-PCR檢測BVDV核酸，結(jié)果顯示在干擾素壓力下，病毒可以耐受干擾素，造成細胞持續(xù)性感染，而此種狀態(tài)下的MDBK細胞仍能感染VSV，且不影響重組boIFN-λ3在此細胞上發(fā)揮抗V