重組犬IFN-γ在HEK293T細胞中的表達及犬IFN-γ腺病毒載體的構建.pdf

1、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)主要由活化的T淋巴細胞和NK細胞產生，絲裂原以及抗原特異性刺激T淋巴細胞克隆也可產生。它除了具有抗病毒、抗腫瘤活性外，還起著重要的免疫調節(jié)作用，如活化巨噬細胞、提高MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子的表達、促進抗原提呈，誘導Th1細胞的分化等，在機體對腫瘤及多種胞內病原感染的免疫控制和免疫病理中起著重要的作用。由于IFN-γ對機體免疫系統(tǒng)具有極大的調節(jié)作用，是機體發(fā)揮免疫功能，清除體內病原體不可缺少

2、的成分。因此IFN-γ既可以作為藥劑用于感染性疾病或腫瘤等的治療，又可以作為免疫佐劑，增強疫苗的免疫效果。 為了建立一套犬IFN-γ(canine interferon-γ，CaIFN-γ)在HEK293T細胞中表達的方法，本研究用伴刀豆球蛋白A(conA)刺激犬脾細胞，通過RT-PCR方法從犬脾細胞中擴增得到犬IFN-γ基因。分離純化擴增片段，并將其克隆到pcDNA3.1A載體中，再轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，經過酶切鑒定

3、篩選出陽性克隆，測序鑒定。構建的真核表達載體pcDNA3.1A-CalFN-γ經磷酸鈣介導轉染HEK293T細胞進行表達。結果表明，克隆的犬IFN-γcDNA基因與GenBank上發(fā)表的序列一致，同源性100％。表達產物經Western-blot方法檢測，證明克隆的犬IFN吖基因能夠在HEK293T細胞中進行表達，并且表達產物能夠分泌到細胞外。犬IFN-γ重組表達質粒的成功構建與真核表達，為以后進行犬IFN-γ活性分析和生物學功能的研究

4、奠定了基礎。 本研究在犬IFN-γ基因進行真核細胞表達的基礎上，構建了犬IFN-γ基因的重組腺病毒載體。采用體外連接的重組腺病毒方法，在表達質粒pcDNA3.1A-CalFN-γ-STOP上通過Kpn I和Adpa I雙酶切獲得包含終止密碼子的CalFN-γ片段，重組到穿梭質粒pShuttle3/gfp)的人巨細胞病毒啟動子(hCMV)和SV40多聚腺苷酸尾(polyA)之間的多克隆位點內，得到重組穿梭質粒pShuttle3/g

5、fp-CalFN- γ，進行酶切鑒定。以PI-Sce I和1-Ceu I雙酶切重組穿梭質粒，獲得含有CMV-CaWN-γ的表達盒，與線性化的腺病毒骨架質粒Adeno-X Viral DNA連接，經Swa I酶切去除Adeno-X Viral DNA自身環(huán)化質粒，再轉化感受態(tài)DH5a，重組成pAdeno-CalFN-γ腺病毒質粒，鑒定成功后再經Pac I酶切線性化并暴露其兩端的反向重復序列(ITTRs)，脂質體法轉染HEK293細胞，待出