犬IFN-γ及IL-2的原核表達(dá)和IL-2生物活性檢測.pdf

1、本文根據(jù)GenBank上發(fā)表的犬干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)和白細(xì)胞介素-2(Interteukin-2，IL-2)基因序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物。采用RT-PCR技術(shù)以ConA刺激的犬脾淋巴細(xì)胞為材料，從總RNA中擴(kuò)增出犬IFN-γ和IL-2基因。分離純化擴(kuò)增片段，克隆入pMD18-T載體，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定及DNA測序分析，表明擴(kuò)增片段為犬IFN-γ和IL-2基因。測序結(jié)果顯示克隆的IFN-γ基因全長426個(gè)核苷

2、酸，編碼141個(gè)氨基酸，與基因庫中CaIFN-γ比較，核苷酸序列同源性為99.8％，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為99.3％；克隆的IL-2基因全長468個(gè)核苷酸，編碼155個(gè)氨基酸，將該序列與基因庫中D30710CaIL-2比較，核苷酸序列同源性為99.36％，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為98.7％。 應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將犬IFN-γ和IL-2基因分別插入到原核表達(dá)載體PJLA605中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒PJLA605-CaIFN-γ和

3、PJLA605-CaIL-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并通過改變誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間來優(yōu)化表達(dá)條件。結(jié)果表明，工程菌PJLA605-CaIFN-γ和PJLA605-CaIL-2在30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期(OD600為1.5)轉(zhuǎn)溫誘導(dǎo)4h，菌體濕重收得量分別達(dá)18.0g/L和17.8g/L，目標(biāo)蛋白表達(dá)量分別占菌體總蛋白的27.4％和29.4％，這兩種基因工程菌得到了理想表達(dá)。SDS-PAGE電泳顯示，NaCl和TritonX-100可洗