IFN-λ重組腺病毒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及對(duì)肺癌影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺癌發(fā)病率高、死亡率高,肺癌患者的五年生存率不到10％,單一治療手段很難收到顯著成效,故倡導(dǎo)腫瘤的多學(xué)科綜合治療。且近年來生物治療在腫瘤治療中扮演了愈來愈重要的角色。
　　 近年來生物治療在腫瘤治療中扮演了愈來愈重要的角色。目前的臨床上應(yīng)用的生物治療手段主要是生物工程藥物如干擾素、白介素-2、生長激素、EPO、TPA、GM-CSF等的使用,但此類藥物價(jià)格昂貴。
　　 干擾素家族是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子之一,其包括Ⅰ型IFN(

2、IFN-α、IFN-β、IFN-κ(等)和Ⅱ型IFN(IFN-γ),近年來發(fā)現(xiàn)了Ⅲ型IFN(IFN-λ家族)。Ⅰ型和Ⅱ型干擾素在諸多研究中均具有抗腫瘤作用,IFN-α作為最早投入臨床使用的生物工程藥品已用于多種腫瘤的臨床治療。本實(shí)驗(yàn)研究IFN-λs抗肺癌作用的價(jià)值。
　　 IFN-λs包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ33個(gè)成員(又稱IL-29、IL-28A和IL-28B)。人IL-29與IL-28A的氨基酸同源性為81

3、％,而人IL-28A與IL-28B的氨基酸同源性則為96％；小鼠只有INF-λ2(IL-28A)和INF-λ3(IL-28B)基因,小鼠的INF-λ2和INF-λ3氨基酸同源性為高達(dá)98％。
　　 IFN-λs抗腫瘤作用可能途徑為:1.抑制腫瘤病毒的復(fù)制2.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖3.調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞4.作用于腫瘤的基質(zhì)細(xì)胞及抗腫瘤血管形成。
　　 國外學(xué)者在T淋巴細(xì)胞瘤BW5147、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤BON1

4、等細(xì)胞的體外細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)IFN-λs具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長作用,而在小鼠黑色素瘤及小鼠纖維肉瘤等的體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)IFN-λs具有抑制腫瘤生長及腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。國內(nèi)對(duì)IL-28和IL-29的研究剛剛起步,對(duì)IFN-λs的研究主要研究基因重組技術(shù)體外抗人肝炎病毒活性,有學(xué)者進(jìn)行人重組IL-28/IL-29質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染的研究,但在其抗腫瘤作用方面尚無相關(guān)報(bào)道。本課題選用鼠INF-λ2(IL-28A)及人IFN-λ1(IL-29)進(jìn)行相

5、關(guān)研究,并致力于探索鼠INF-λ2重組腺病毒載體對(duì)肺癌的影響方面進(jìn)行體內(nèi)外研究。
　　 本研究的目的在于:
　　 1.構(gòu)建出高滴度的重組mIFN-λ2腺病毒載體及重組hIFN-λ1腺病毒載體,并建立穩(wěn)定表達(dá)鼠λ2-干擾素的CHO細(xì)胞系,為進(jìn)行體內(nèi)外抗腫瘤研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 2.通過重組mIFN-λ2腺病毒感染LA795細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究,并通過細(xì)胞凋亡、PCR等檢測(cè),探討mIFN-λ2對(duì)腫瘤細(xì)胞LA795的

6、生長影響及其機(jī)制。
　　 3.通過重組mIFN-λ2腺病毒對(duì)LA795荷痛鼠的體內(nèi)轉(zhuǎn)染后影響的研究,測(cè)定一些免疫指標(biāo)(NK、CD8+等),進(jìn)一步探討IFN-λs對(duì)肺癌的治療機(jī)制。
　　 研究方法如下:
　　 1.mIFN-λ2及hIFN-λ1基因克隆表達(dá)載體的構(gòu)建及抗病毒活性鑒定。
　　 2.重組mIFN-λ2及hIFN-λ1腺病毒載體構(gòu)建及腺病毒包裝①mIFN-λ2及hIFN-λ1基因業(yè)克隆入腺病毒穿梭

7、載體,pShuttle-CMV-mIFN-λ2及pShuttle-CMV-hIFN-λ1的構(gòu)建。
　　 ②同源重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建即Ad-pshuttle-cmv-hIFN-λ1及Ad-pshuttle-cmv-mIFN-λ2的構(gòu)建。
　　 ③重組腺病毒載體的包裝和擴(kuò)增。
　　 3.重組mIFN-λ2及hIFN-λ1腺病毒鑒定及病毒滴度測(cè)定①基因組試劑盒提取重組mIFN-λ2及hIFN-λ1腺病毒的DNA基因組,

8、PCR鑒定mIFN-λ2及hIFN-λ1是否導(dǎo)入包裝的腺病毒中。
　　 ②Western blot鑒定重組mIFN-λ2腺病毒感染細(xì)胞后mIFN-λ2蛋白的表達(dá)。
　　 ③XCID50法對(duì)構(gòu)建的腺病毒滴度進(jìn)行測(cè)定。
　　 4.重組mIFN-λ2腺病毒作用小鼠肺腺癌(LA795)的體外研究①重組mIFN-λ2腺病毒感染小鼠肺腺癌(LA795)細(xì)胞,MTT泫測(cè)定細(xì)胞增殖情況。
　　 ②重組mIFN-λ2腺病毒

9、感染小鼠肺腺癌(LA795)細(xì)胞,Tunnel測(cè)LA795的細(xì)胞凋亡情況。
　　 ③重組mIFN-λ2腺病毒感染小鼠肺腺癌(LA795)細(xì)胞,Real-time PCR測(cè)mIFN-λ2的mRNA的基因表達(dá)。
　　 5.體內(nèi)的作用機(jī)制研究①昆明鼠LA795腫瘤模型的制備病理檢查后證實(shí)鼠LA795腫瘤模型的成功建立。
　　 ②重組mIFN-λ2腺病毒載體對(duì)致瘤小鼠的干預(yù)。
　　 ③腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)生長情況的指標(biāo)

10、測(cè)定④流式細(xì)胞儀對(duì)免疫指標(biāo)(NK、CD4+、CD8+細(xì)胞)測(cè)定⑤上述動(dòng)物腫瘤組織用Tunnel測(cè)定腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。
　　 ⑥PCR檢測(cè):PCR檢測(cè)腫瘤組織的mIFN-λ2mRNA水平。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS6.12版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 研究結(jié)果如下:
　　 1.hIFN-λ1基因克隆、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及抗病毒活性測(cè)定1.1 hIFN-λ1基因克隆和PCR產(chǎn)物分析經(jīng)VSV病毒誘導(dǎo)的人He

11、La細(xì)胞mRNA用RT-PCR擴(kuò)增。其產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,出現(xiàn)大小約為610bp,與所需克隆的hIFN-λ1基因大小相一致。
　　 1.2 PMD18-T-hIFN-λ1 Vector的酶切鑒定和測(cè)序?qū)⒖寺〉膆IFN-λ1目的基因與Vector測(cè)序載體重組連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌,陽性克隆擴(kuò)增,提取質(zhì)粒PMD18-T-hIFN-λ1 Vector酶切鑒定,出現(xiàn)610 bp大小的帶,測(cè)序與GenBank上報(bào)道的序列完全一致。<

12、br>　　 1.3 PCAGG-hIFN-λ1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及篩選鑒定將PMD18-T-hIFN-λ1 Vector質(zhì)粒酶切處理得到目的片段,PCAGG載體酶切處理,將酶切下片段與處理的載體重組連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌,挑取陽性克隆擴(kuò)增酶切鑒定,出現(xiàn)610 bp大小的帶。
　　 1.4 hIFN-λ1抗病毒活性測(cè)定用VSV*GFP-A549細(xì)胞系測(cè)定PCAGG-hIFN-λ1轉(zhuǎn)染上清的抗病毒活性,結(jié)果顯示:未加病毒的陰性

13、對(duì)照組沒有熒光,PCAGG空載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞的上清處理的細(xì)胞孔和BHK-21常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞的上清處理的細(xì)胞孔出現(xiàn)大量熒光,VSV*GFP-A549在A549細(xì)胞上大量復(fù)制；PCAGG-hIFN-λ1101～104倍稀釋時(shí)能抑制病毒復(fù)制,105倍稀釋時(shí)病毒復(fù)制與對(duì)照組無差異,104倍稀釋孔熒光亮度約為對(duì)照組的一半,PCAGG-hIFN-λ1活性104IU/mL。
　　 2.mIFN-λ2基因克隆及鑒定2.1 mIFN-λ2基

14、因克隆和PCR產(chǎn)物分析VSV病毒誘導(dǎo)鼠脾臟細(xì)胞mRNA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)大小約為582 bp的條帶,大小與所需克隆的mIFN-λ2基因大小相一致。
　　 2.2 PMD18-T-mIFN-λ2的酶切鑒定和測(cè)序克隆的mIFN-λ2目的基因與PMD18-T Vector測(cè)序載體重組連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌,陽性克隆擴(kuò)增,提取質(zhì)粒酶切處理酶切出現(xiàn)約582 bp的帶,測(cè)序結(jié)果與GenBank上報(bào)道的完全一致

15、。
　　 3.hIFN-λ1基因及mIFN-λ2基因亞克隆入腺病毒穿梭載體及同源重組腺病毒質(zhì)粒酶切分別將PMD18-T-hIFN-λ2及PMD18-T-mIFN-λ2和pShuttle-CMV,將hIFN-λ1及mIFN-λ2片段插入到pShuttle-CMV上,轉(zhuǎn)化細(xì)菌,挑選克隆進(jìn)行酶切鑒定,分別出現(xiàn)610 bp及582 bp大小的帶。將pShuttle-CMV-hIFN-λ1及pShuttle-CMV-mIFN-λ2載體線性

16、化后電穿孔轉(zhuǎn)化含有pAd-Easy骨架載體BJ5183感受態(tài)細(xì)菌,取質(zhì)粒并PacⅠ酶切鑒定,分別出現(xiàn)20×103bp和4.5×103bp大小的帶,表明重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mIFN-λ2構(gòu)建成功。重組腺病毒pAd-mIFN-λ2及pAd-hIFN-λ1質(zhì)粒采用PCR擴(kuò)增鑒定,分別出現(xiàn)約582 bp和610 bp的帶。
　　 4.TCID50法對(duì)構(gòu)建的腺病毒滴度進(jìn)行測(cè)定Ad-mIL-28病毒滴度為:3×108pfu/ml；pAd-

17、hIL-29的病毒滴度為:4×107pfu/ml。
　　 5.免疫熒光檢測(cè)mIL-28蛋白的表達(dá)LA795細(xì)胞分別感染重組腺病毒Ad-mlFN-λ2、Ad-LacZ,與對(duì)照組相比,結(jié)果顯示PBS組、Ad-LacZ組在任何時(shí)段都未見紅色熒光,Ad-mIFN-λ2組在12h、24h也未見紅色熒光表達(dá),36h、48h、72h時(shí)均可見紅色熒光,且隨時(shí)間有表達(dá)增多趨勢(shì)。
　　 由此得出以下結(jié)論:
　　 1.成功地構(gòu)建了PC

18、AGG-hIFN-λ1及PCAGG-hIFN-λ2,并能高效地轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞等,且具有較強(qiáng)的抗病毒活性。
　　 2.成功地構(gòu)建了PCAGG-EGFP-mIFN-λ2并能高效穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞等,且具有較強(qiáng)的抗病毒活性,且與誘導(dǎo)Mx1抗病毒蛋白密切相關(guān)。
　　 3.成功地構(gòu)建了Ad-hIFN-λ1及Ad-mIFN-λ2并高效地轉(zhuǎn)染至LA795細(xì)胞、293A細(xì)胞等。
　　 4.體外試驗(yàn)Ad-mIFN-λ2