重組腺病毒載體Ad-LMP-1的構建及其轉染MSC后成骨活性檢測.pdf

1、研究背景： 骨質疏松及其相關骨折嚴重影響老年人的生活質量，并由此帶來巨大的經濟和社會健康負擔；骨質疏松及其骨折的治療多年以來一直是困繞骨科臨床醫(yī)生的難題之一，隨著我人口的老齡化，骨質疏松及其骨折患者也將逐漸增加，因此尋找新的、療效切實可靠且具有突破性進展的治療方法具有重大的現(xiàn)實意義。 骨質疏松基本病理機制為骨吸收和形成(骨重建偶聯(lián))的失衡，骨形成的不足，或(和)骨吸收的增強導致骨量的減少，骨組織微結構的退變、骨脆性增加和

2、骨強度下降，骨折的易感性增加，骨折后的愈合能力顯著降低。MSCs是成體干細胞之一，具有多向分化潛能，可分化為成骨細胞、軟骨細胞和等多種細胞，骨質疏松個體的MSCs數(shù)量減少，質量也下降，增殖和成骨細胞分化能力減弱，成骨能力也顯著降低[1]。MSCs轉染相關誘導因子基因后，不僅其增殖能力沒有受到影響，而且可以加強其定向分化的能力，比如轉導入骨誘導基因后，能有效促進骨的形成，修復骨缺損[2]，從而為骨質疏松及其骨折的基因治療提供了一個新的平臺

3、。 骨誘導因子是一類可促進局部或全身骨形成的的生物分子。LMP-1作為細胞內信號分子，啟動體內骨的形成的同時，刺激包括多種BMPs在內不同骨誘導因子合成和分泌，促進臨近的細胞分化并直接參加骨膜或軟骨內成骨[3]，為骨折的修復提供非常有利的環(huán)境，因此是理想的候選基因。MSCs的生物學特性表明它該基因最佳的載體。與其它慢性疾病不同，OP骨折的治療不必也不需要讓所轉染的基因長達數(shù)周或數(shù)月持續(xù)的表達直至疾病痊愈，因而使轉基因方法更加切實

4、可行。 目的： 利用重組腺病毒載體Ad—LMP-1體外轉染MSCs，通過對轉染前后細胞成骨活性的檢測，明確LMP-1基因的成骨促進作用，為基因治療骨質疏松做基礎研究 方法： 1.分離培養(yǎng)SD大鼠成骨細胞，提取提取總RNA，設計特異性引物并RT—PCR獲取LMP-1基因，電泳驗證，切膠回收純化。 2.利用gateway技術構建Ad—LMP-1重組腺病毒載體，并行相關酶切電泳以及測序驗證。 3

5、.重組腺病毒載體在293A細胞中的包裝。并初步確定感染復數(shù)MOI 4.分離培養(yǎng)大鼠MSC細胞，鑒定。 5.利用重組腺病毒感染第三代MSC細胞，通過Western—bloting檢測LMP-1基因在MSCs中的表達；通過檢測堿性磷酸酶、膠原蛋白I、骨鈣素以及，驗證LMP-1基因的成骨促進作用。 結果： 1.成功體外分離培養(yǎng)SD大鼠成骨細胞以及提取總RNA，利用RT—PCR獲取LMP-1基因，通過電泳初步鑒定

6、。 2.成功構建重組腺病毒載體AdLMP-1，通過酶切電泳以及測序驗證完全正確。 3.通過兩次轉染293細胞，提取病毒DNA，PCR鑒定成功；成功確定重組腺病毒載體感染復數(shù)。 4.成功分離培養(yǎng)SD大鼠MSC細胞，并通過成脂、成骨誘導鑒定以及表面標記物鑒定。 5.重組腺病毒感染MSC細胞后，可檢測LMP-1基因的表達，并且通過與對照組的比較，驗證了LMP-1基因的成骨促進作用。 結論： 利用