APP亞片段真核細胞載體的構建及其在HEK-293T細胞中的表達.pdf

1、研究目的:目前AD的疫苗研制大多都是以Aβ為靶點進行的。但通過內吞作用沉積于細胞內的Aβ同樣會影響AD的發(fā)生發(fā)展。可大多數(shù)抗體不能進入細胞內,故對此顯得束手無策。因此從源頭減少Aβ的產(chǎn)生就顯得尤為重要。本實驗探索APPβ剪切位點上游區(qū)域,欲從中尋找出對Aβ生成起到調控作用的結構,從而為尋找新的治療靶位及下一步新型疫苗的研發(fā)打下基礎。
　　 實驗方法:構建加載有APPsw695亞片段基因與GFP融合基因的pcdna3.1+真核細胞

2、載體,其中亞片段基因包括APPl-695、APP265-695、APP507-695及APP590-695等多核苷酸鏈。構建后經(jīng)通過測序,符合預期要求。將重組質粒及空質粒利用脂質體轉染法分別轉染至HEK-293T細胞中,作為實驗組。以未轉染的HEK-293T細胞作為對照組。轉染36小時后通過WB(Westernblot)方法對Aβ產(chǎn)量進行半定量分析及MTT法的對細胞活性進行檢測。所得計量數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行x2檢驗,檢驗

3、水準Q=0.05,P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 實驗結果:
　　 1.經(jīng)優(yōu)化設計后的片段于大腸桿菌中擴增量較高且對宿主增殖無明顯影響,經(jīng)測序證實符合預期要求。
　　 2.轉染后分別于24h、36h、48h于倒置顯微鏡下對細胞形態(tài)進行觀測,發(fā)現(xiàn)貼壁率逐漸下降,且各培養(yǎng)基顏色未見變化提示無消耗產(chǎn)酸跡象。至60h左右,各組細胞完全脫壁,聚集成團懸浮于培養(yǎng)液中。
　　 3.對各組細胞轉染36h后上清液中A

4、B進行檢測,于4.5KD位置無明顯條帶顯影。
　　 結論:
　　 1.將突變基因點對應基因(APPsw695:K595N、M596L)優(yōu)化為符合細菌宿主的AATCTG與AACCTG,有助于細菌的轉化及質粒的擴增。
　　 2.利用脂質體轉染法在對HEK-293T細胞進行APPSWI-695轉染過程中發(fā)現(xiàn),轉染后細胞存活率逐漸下降直至死亡,提示此種細胞可能不適用于AD模型的制造。接觸性抑制弱的細胞可能成為AD模型的首

5、選。
　　 3.雖然Aβ作為“瀑布級聯(lián)學說”的起始致病因素,但APP所造成細胞間的相互交聯(lián),可能也對細胞的活性也產(chǎn)生負性影響,其在發(fā)病過程中的作用較以往認識更為重要。
　　 4.WB技術在對小分子蛋白的檢測中仍表現(xiàn)欠佳,因此目前研究Aβ應避免采取此種方法進行檢測。
　　 5.在體外Aβ可能進一步聚合成多聚體形式,從而造成WB的特異性一抗,對于此產(chǎn)物并不能識別,因此造成此次試驗的假陰性結果。進一步探索Aβ體外多聚體