hTERT哺乳動物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在人源細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、端粒（Telomeres）是線狀染色體末端的特殊的重復(fù)DNA序列，在高分化的正常人體細(xì)胞中，它的長度隨著細(xì)胞的分裂而逐漸縮短。端粒的長度可以反映細(xì)胞的復(fù)制史及其復(fù)制潛能。端粒酶（Telomerase）是細(xì)胞中負(fù)責(zé)延長端粒的一種酶，除了干細(xì)胞、生殖細(xì)胞和其他具有高度增殖能力的細(xì)胞外，在正常細(xì)胞中很少表達(dá)。細(xì)胞中端粒酶的高表達(dá)可以維持端粒的長度從而使細(xì)胞獲得永生化。端粒酶由人端粒酶RNA成分(hTR),人端粒酶相關(guān)蛋白(hTP)和人端粒酶逆

2、轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)，且hTERT mRNA的表達(dá)水平與端粒酶的活性呈正相關(guān)。相關(guān)研究已經(jīng)表明，hTERT在腫瘤的免疫治療領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。
　　目的：
　　本課題擬構(gòu)建hTERT基因哺乳動物表達(dá)載體pCI-neo-hTERT，并觀察其在人類白血病細(xì)胞系K562中的表達(dá)，為進(jìn)一步探討hTERT在骨腫瘤方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定從人骨肉瘤細(xì)胞系HOS中提取總RNA，并逆

3、轉(zhuǎn)錄成cDNA；對逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA行PCR以獲得目的片段，電泳位置合適后切膠回收以純化基因。將目的基因片段及pCI-neo載體質(zhì)粒通過NotⅠ、EcoRⅠ雙重酶切后，連接到一起，并轉(zhuǎn)化到大腸埃希氏菌DH5α中。挑選出單克隆菌株，并進(jìn)行菌液、重組質(zhì)粒的PCR鑒定。選取經(jīng)鑒定含有目的基因的質(zhì)粒，行DNA測序分析，并將結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行BLAST比對，以驗(yàn)證質(zhì)粒中是否已正確插入hTERT基因。
　　二、重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定
　

4、　將重組并鑒定后無誤的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中，并用G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，比較轉(zhuǎn)染后細(xì)胞與轉(zhuǎn)染前細(xì)胞hTERT的表達(dá)水平。
　　三、hTERT對于細(xì)胞增殖的影響
　　選取高表達(dá)hTERT的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株，利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的改變。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建了pCI-neo-hTERT哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒。
　　2、成功獲得過表