抗人CD45抗體哺乳細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定.pdf

1、【目的】
　　構(gòu)建兩種新型抗人CD45哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)表達(dá)載體，利用DHFR系統(tǒng)篩選出能穩(wěn)定高表達(dá)抗CD45基因工程抗體的細(xì)胞株，為以人CD45為靶點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　（1）PCR擴(kuò)增得到抗CD45抗體的輕鏈可變區(qū)VL區(qū)和重鏈可變區(qū)VH區(qū)基因，通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建抗人CD45抗體的真核表達(dá)載體，得到Anti-CD45-scFv-Fc與pBudce-CD45[H+L]。
　?。?）將兩者轉(zhuǎn)染HEK

2、-293T細(xì)胞獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)，用Elisa方法檢測(cè)兩種真核表達(dá)載體的抗體表達(dá)量的差異。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種抗體與CD45-/+細(xì)胞系的結(jié)合。
　　（3）采用抗原抗體系統(tǒng)和生物素親合素系統(tǒng)Western blot方法，鑒定抗體與CD45分子的結(jié)合特異性。
　　（4）挑選表達(dá)量較高，結(jié)合活性好以及具有結(jié)合特異性的抗體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。篩選出穩(wěn)定高表達(dá)Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO細(xì)胞株。
　　【結(jié)果

3、】
　?。?）通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將抗體基因片段分別克隆至載體，得到載體Anti-CD45-scFv-Fc與pBudce-CD45[H+L]，經(jīng)測(cè)序鑒定顯示其載體DNA序列正確，表明兩種哺乳細(xì)胞表達(dá)載體均構(gòu)建成功。
　　（2）用Elisa方法檢測(cè)Anti-CD45-scFv-Fc與pBudce-CD45[H+L]兩種載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后的抗體瞬時(shí)表達(dá)量分別為2mg/L和0.3mg/L。
　　（3）采用流式細(xì)胞術(shù)

4、檢測(cè)結(jié)果表明，Anti-CD45-scFv-Fc載體表達(dá)的抗體與CD45+多種細(xì)胞株（KG1a，K562，Jurkat）結(jié)合活性接近單克隆抗體，而與CD45-的多種細(xì)胞株（HepG2，A549，B16，HU）結(jié)合活性低。pBudce-CD45[H+L]載體表達(dá)量過(guò)低，因此選擇表達(dá)量高的Anti-CD45-scFv-Fc載體用于后序?qū)嶒?yàn)。
　?。?）Western blot鑒定結(jié)果表明Anti-CD45-scFv-Fc載體表達(dá)的抗體

5、與高表達(dá)CD45分子細(xì)胞株總蛋白在250kD處有結(jié)合條帶，符合CD45分子理論值170-250kD，而與不表達(dá)CD45分子的細(xì)胞株總蛋白在相同位置無(wú)結(jié)合條帶。同時(shí)，Anti-CD45-scFv-Fc抗體與生物素標(biāo)記的人CD45（rhCD45）作用，HRP標(biāo)記的親和素顯色，還原抗體與非還原抗體分別在約60kD和120 kD處有結(jié)合，符合單價(jià)抗體（包含F(xiàn)c段）與雙價(jià)抗體分子量大小，證實(shí)所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞成功表達(dá)雙價(jià)抗體，并可與CD

6、45分子的特異性結(jié)合，達(dá)到了預(yù)計(jì)形成的抗體結(jié)構(gòu)模式。
　?。?）用DHFR系統(tǒng)篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO細(xì)胞，并證實(shí)了該系統(tǒng)對(duì)抗體的結(jié)合活性等無(wú)明顯影響，可大量表達(dá)抗體進(jìn)行后續(xù)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。
　　【結(jié)論】
　　成功改造鼠源性單克隆抗CD45抗體，構(gòu)建了表達(dá)抗人CD45抗體的哺乳細(xì)胞表達(dá)載體Anti-CD45-scFv-Fc，DHFR系統(tǒng)篩選獲得穩(wěn)定高表達(dá)Anti-CD45-scF