人KCTD9真核表達(dá)質(zhì)粒及慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、背景及目的：
　　我國乙型病毒性肝炎發(fā)病率高(約5％),在慢性乙型肝炎基礎(chǔ)上誘發(fā)的重型肝炎病情尤為兇險(xiǎn),病情進(jìn)展迅速,病死率較高,可達(dá)到70%以上,一直備受臨床醫(yī)生和研究人員的重視。目前內(nèi)科治療對于該疾病的作用有限,雖然肝移植是終末期肝病治療的最終選擇,但因我國面臨嚴(yán)重的供體短缺、移植價(jià)格昂貴等問題而受到臨床應(yīng)用的限制,因此免疫治療為重型肝炎的治療提供了新的思路。重型乙型肝炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及到病毒和宿主雙重因素。其中免疫介導(dǎo)的肝

2、細(xì)胞損傷中,乙型肝炎病毒(HBV)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)細(xì)胞的作用及機(jī)制已經(jīng)得到較好闡明,而非特異性免疫在其中的作用卻尚不明確。本研究室的前期研究首次揭示肝臟自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)在病毒誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
　　本研究室前期通過基因芯片對重癥乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因差異表達(dá)譜研究,發(fā)現(xiàn)離子通道相關(guān)基因--potassium channel tetramerisatio

3、n domain containing 9(KCTD9)在慢性乙肝的重癥階段患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中高度表達(dá),是重型乙型肝炎的一個(gè)下調(diào)基因。進(jìn)一步通過對我研究室建立的不同類型的小鼠肝炎模型和不同臨床類型的乙型肝炎患者(重型肝炎和輕中度慢性肝炎患者)及健康對照組患者外周淋巴細(xì)胞和肝淋巴細(xì)胞的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),KCTD9表達(dá)水平在外周血NK細(xì)胞和肝臟NK細(xì)胞上顯著增高,其表達(dá)與重型肝炎患者肝臟受損的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。對鼠三型肝炎病毒

4、(MHV-3)誘導(dǎo)的Balb/cJ暴發(fā)型肝炎小鼠模型中干預(yù)KCTD9的表達(dá),能夠有效抑制NK細(xì)胞活化及延緩暴發(fā)型肝炎的疾病進(jìn)展。這一系列研究為進(jìn)一步探討重癥肝炎的肝細(xì)胞損傷機(jī)制,提供了新的方向和疾病干預(yù)靶點(diǎn)。
　　為進(jìn)一步研究KCTD9的免疫功能,本研究克隆了人KCTD9開放閱讀框(ORF)全長,構(gòu)建其表達(dá)質(zhì)粒。同時(shí),為進(jìn)行進(jìn)一步的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)研究,我們構(gòu)建了該基因的慢病毒表達(dá)載體。這些均為KCTD9分子的功能研究提供了強(qiáng)有

5、力的前提保證,也為下一步的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1.收集重型乙型肝炎病人外周血,提取PBMC的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板,PCR方法擴(kuò)增KCTD9ORF區(qū),并連接到pcDNA3.1質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,陽性克隆PCR后小提質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切及雙向測序鑒定。
　　2.構(gòu)建pGC-FU-KCTD9慢病毒載體,通過測序結(jié)果和利用westernblot技術(shù)從蛋白質(zhì)方面鑒定含有KCTD9的目的片段的

6、表達(dá)。經(jīng)過包裝純化,含目的基因的慢病毒顆?？梢垣@得較高滴度,為進(jìn)行下一步的生物學(xué)功能研究做鋪墊。
　　研究結(jié)果：
　　1.觀察雙酶切的結(jié)果及測序結(jié)果證實(shí)從PBMC中獲得的KCTD9基因連接到pcDNA3.1載體上,除第693位堿基由胸腺嘧啶突變胞嘧啶為外,其余都與NCBI基因文庫中KCTD9基因切合,該處突變屬于同義突變,不會(huì)影響其蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)的生理功能。
　　2.成功構(gòu)建pGC-FU-KCTD9表達(dá)質(zhì)粒,