人ATP2A3基因慢病毒shRNA載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建人 ATP2A3基因慢病毒 shRNA載體并進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步探討鹽霉素通過(guò)調(diào)控ATP2A3基因抗腫瘤干細(xì)胞的機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)材料。
　　方法：1.構(gòu)建4條ATP2A3基因慢病毒shRNA載體：將目的基因干擾序列連接到pGMLV-SC1 RNA干擾慢病毒載體后將其轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞中，等生成單克隆菌落后行PCR測(cè)序鑒定，測(cè)序比對(duì)正確的克隆即為所需的ATP2A3基因 RNAi慢病毒載體。2.包裝慢病毒及測(cè)定病毒滴度：抽提高

2、純度、無(wú)內(nèi)毒素的慢病毒shRNA載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，使用HG transgene reagent將兩者共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，通過(guò)促轉(zhuǎn)染、換液、培養(yǎng)等處理后，獲取細(xì)胞上清液，進(jìn)一步經(jīng)濃縮后獲得高滴度慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中標(biāo)定其病毒滴度。3.干擾載體對(duì)PC-3細(xì)胞內(nèi)ATP2A3的沉默評(píng)價(jià)：用包裝好的慢病毒以及慢病毒陰性對(duì)照感染靶細(xì)胞PC-3，感染成功后通過(guò)Western Blot和RT-PCR方法評(píng)價(jià)干擾載體對(duì)靶基因的干擾

3、效果。
　　結(jié)果：1.對(duì)構(gòu)建好的4條慢病毒干擾載體經(jīng)PCR測(cè)序鑒定，DNA序列均無(wú)位點(diǎn)突變，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.將構(gòu)建好的慢病毒載體質(zhì)粒陽(yáng)性克隆菌株轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光；在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，最終純化出pGMLV-SC1-ATP2A3慢病毒顆粒，并測(cè)得其滴度為1*109 TU/ml。3.病毒感染靶細(xì)胞后，經(jīng)Western blot及RT-PCR驗(yàn)證，4條shRNA均有一定的沉默，其中以ATP2A3-