IK6基因特異性ShRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：
　　采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選出對(duì)IK6基因抑制效率較高的一對(duì)小干擾RNA(smallinterferingRNA,SiRNA),進(jìn)而構(gòu)建IK6基因短發(fā)夾狀RNA(shorthairRNA,shRNA)慢病毒載體及鑒定其沉默功能,為進(jìn)一步研究IK6基因在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中的作用提供載體工具。
　　方法：
　　利用互聯(lián)網(wǎng)資源,設(shè)計(jì)并合成三對(duì)針對(duì)IK6基因可能有效的SiRNA,脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染急性淋巴細(xì)胞白

2、血病細(xì)胞系Sup-B15,熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;采用RT-PCR、Western-Blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)從基因、蛋白水平檢測(cè)IK6的表達(dá),篩選出對(duì)Sup-B15細(xì)胞系IK6基因沉默效率最高的一對(duì)SiRNA序列;然后經(jīng)化學(xué)合成OligoDNA,退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切后的GV112載體連接轉(zhuǎn)化得到pLV-shIK6慢病毒表達(dá)載體,用PCR法篩選陽性克隆并測(cè)序鑒定。將pLV-shIK6、pHelper1.0

3、和pHelper2.0三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生重組慢病毒并濃縮,以孔稀釋法測(cè)定病毒滴度。慢病毒感染Sup-B15細(xì)胞后,熒光顯微鏡觀察慢病毒感染Sup-B15細(xì)胞的效率,RT-PCR及Western-Blot檢測(cè)IK6在感染慢病毒后Sup-B15細(xì)胞中的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　熒光顯微鏡下觀察到約80％左右的細(xì)胞帶紅色熒光;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SiRNA片段經(jīng)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Sup-B15細(xì)胞的效率為80.41%;

4、與對(duì)照組相比,三對(duì)SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Sup-B15細(xì)胞IK6mRNA、蛋白表達(dá)均顯著抑制(P﹤0.001),其中SiRNA-2組沉默效率最高,且與時(shí)間呈正相關(guān)。PCR和測(cè)序證實(shí),成功構(gòu)建IK6-shRNA的慢病毒表達(dá)載體pLVshIK6。包裝慢病毒,濃縮病毒懸液的滴度為8×108TU/ML,滿足實(shí)驗(yàn)需要。當(dāng)感染倍數(shù)(MOI)為100時(shí),Sup-B15細(xì)胞的感染率可達(dá)到80%。感染后的Sup-B15細(xì)胞Ik6在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)明顯下調(diào)(