靶向hTERT的肝特異性RNAi載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目前,基因治療在腫瘤治療方面已經(jīng)取得了較大進(jìn)展,RNA干擾(RNAinterference)技術(shù)作為腫瘤基因治療的一個(gè)主要的手段已經(jīng)得到廣泛的關(guān)注和研究,但是由于非靶基因治療限制了其在臨床方面的應(yīng)用,如何將靶基因準(zhǔn)確地傳遞至靶部位成為該領(lǐng)域研究的一個(gè)重要的突破口。為了確保治療基因傳遞至靶細(xì)胞而不傷害到正常細(xì)胞或者其它組織器官,目前靶向性載體轉(zhuǎn)錄、特異性啟動(dòng)子、自殺基因療法等方式已經(jīng)在各自的研究領(lǐng)域里取得了一定的進(jìn)展。本研究采用組織特異性

2、啟動(dòng)子誘導(dǎo)shRNA在肝臟中特異性表達(dá)的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)肝癌基因治療的靶向性。
　　 首先,我們選擇了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)作為治療的靶點(diǎn)。hTERT在大部分惡性腫瘤中表達(dá),在正常組織中不表達(dá),并且多項(xiàng)研究表明hTERT是腫瘤細(xì)胞永生化主要促因,hTERT表達(dá)的下調(diào)對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展有抑制作用,這使得hTERT成為腫瘤基因治療的一個(gè)理想的靶標(biāo)。由此,我

3、們?cè)O(shè)計(jì)了4個(gè)不同的shRNA干擾片段,并在pRS載體上由U6啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá),分別命名為pRS-shT1、pRS-shT2、pRS-shT3、pRS-shT4。另外設(shè)計(jì)一個(gè)陰性對(duì)照載體,該載體的shRNA片段的29nt靶序列中含有一段無(wú)意義片段,也就是非靶向hTERT基因片段,命名為pRS-shT5。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選等實(shí)驗(yàn),對(duì)其抑制率進(jìn)行了評(píng)估,最終選出在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中對(duì)hTERT抑制效果最好的shRNA干擾片段。

4、r>　　 其次,本研究采用apoA-I核心啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)RNAi的肝組織特異性,為了增強(qiáng)RNAi效果,采用原核增強(qiáng)子的修飾方式增強(qiáng)apoA-I啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。我們選用了CMV(人巨細(xì)胞病毒基因)和SV40(猴空泡病毒40,猿猴病毒40或猴病毒40)增強(qiáng)子。
　　 最后,由修飾后的apoA-I啟動(dòng)子啟動(dòng)該片段的表達(dá),并且為了避免RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子引起的脫靶效應(yīng),將Ribozyme和MAZ結(jié)構(gòu)應(yīng)用于shRNA干擾載體上,Riboz

5、yme和MAZ結(jié)構(gòu)避免脫靶效應(yīng)的功能在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中已得到確證,在獲得一個(gè)完整的肝靶向RNA干擾表達(dá)載體之后,評(píng)價(jià)此肝靶向的RNA干擾表達(dá)載體的效果。
　　 此外,大量研究表明,表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR,在肝癌細(xì)胞中EGFR信號(hào)的平均表達(dá)量是正常肝細(xì)胞中的兩倍,EGFR在92％的肝癌細(xì)胞細(xì)胞膜上都過(guò)表達(dá)。并據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,EGFR本身表達(dá)的抑制會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展,同時(shí)EGFR表達(dá)的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致hTERT基因表達(dá)的上調(diào),故基于上述

6、研究結(jié)果,本研究選用了apoA-I啟動(dòng)子啟動(dòng)的靶向EGFR基因的RNA干擾表達(dá)載體,Western-blot檢測(cè)hTERT和EGFR表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染是否能夠獲得雙重下調(diào)hTERT的效果。
　　 研究結(jié)果表明,1)4個(gè)shRNA干擾片段均具有不同程度的RNA干擾效果,并且pRS-shT2載體的效果最好,pRS-shT2的shRNA可以作為進(jìn)一步研究的靶序列；2)CMV增強(qiáng)子對(duì)apoA-I啟動(dòng)子的修飾顯示出了相對(duì)其它增強(qiáng)子的優(yōu)勢(shì),CM