靶向hTERT可調控慢病毒載體RNAi治療口腔鱗癌的研究.pdf

1、目的:理想化的腫瘤治療是以多學科綜合治療的手段達到延長患者生存時間和改善患者生存質量的目的。鱗狀細胞癌是頭頸—口腔頜面部最多發(fā)惡性腫瘤，目前臨床主要是采取以外科手術為主，輔以化、放療等多種方法的治療模式，但腫瘤的局部復發(fā)和遠處轉移往往導致治療失敗。在外科術式日臻成熟的今天，頭頸—口腔頜面部惡性腫瘤治療的遠期效果即5年期生存率卻無明顯改善，外科手術不可避免會導致患者不同程度的顏面部缺損、畸形和相應功能障礙、身心創(chuàng)傷。探索其它配合治療手段有

2、望進一步提升口腔鱗癌的治療效果。腫瘤是涉及多種基因、多步驟改變的基因疾病，因此，在研究腫瘤發(fā)病的分子機制基礎上，基因治療作為對因治療，是最終征服癌癥的希望所在，作為一種新的疾病治療手段，基因治療將改變人類疾病治療的歷史進程。 RNA干擾(RNAi)是生物體內抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象：當細胞中導入與內源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，在核酸酶Dicer作用下可將長雙鏈RNA降解為21-23bp的小分子干擾RNA(siRNAs

3、)，siRNAs結合其他元件形成RNA誘導沉默復合物(RISCs)，結合并切割mRNA，敲減目的基因的表達，達到基因沉默效果。RNAi具有高度特異性、高效性，相對安全、簡便的優(yōu)勢，已經成為研究基因功能的重要工具，并將在臨床應用等眾多領域取得突破性成果。 惡性腫瘤的一個重要特征是細胞永生化，端粒和端粒酶作為維持染色體的穩(wěn)定的主要結構和細胞壽命的“生物鐘”，特別是端粒酶活性的主要限速性組分：人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)在超過85％

4、以上的惡性腫瘤(包括頭頸—口腔頜面部鱗狀細胞癌)細胞中特異性的持續(xù)表達可視為腫瘤細胞永生化、增殖性增強的關鍵因素，可望作為腫瘤鑒別診斷、基因治療的理想靶標。 基因治療的關鍵和基礎是基因轉移，目的基因導入靶細胞并使之表達是其關鍵環(huán)節(jié)。基因轉移的非病毒學的基因轉移方法效率較低，人體實驗的基因治療方案絕大多數(shù)是以病毒學方法進行基因轉移的?；谌祟惷庖呷毕莅Y病毒(HIV-1)基礎上制備的慢病毒載體已發(fā)展成為一種高效、安全的基因載體。慢病

5、毒載體具有諸多優(yōu)點：轉移基因片段容量大、不易誘發(fā)宿主免疫反應；不僅能感染分裂細胞，還能用于感染不分裂細胞；可穩(wěn)定整合于靶細胞的基因組，能在多種組織、器官中介導長期而穩(wěn)定的轉基因表達，治療基因表達時間可長達六個月之久。慢病毒載體系統(tǒng)經歷了10余年4個階段發(fā)展：在構建時把HIV-1基因組中進行包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用元件與編碼反式作用蛋白的序列分離，分別構建在三個獨立的質粒表達系統(tǒng)上，即包裝質粒、包膜質粒和載體質粒；并在包裝質粒中刪

6、去了HIV-1的所有附屬基因；刪除了U3區(qū)的3'LTR，使載體失去HIV-1增強子及啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉錄出RNA；去除了tat基因代之以異源啟動子序列，這樣原始的HIV基因組中的9個基因在制備的HIV慢病毒載體中只保留了3個(gag、pol和rev)；最后加入調控元件形成可誘導基因轉導系統(tǒng)。三質粒系統(tǒng)通過共轉染包裝細胞便能收獲只有一次感染能力、而無復制能力、具有自身失活特性的病毒載體顆粒。 目前基因治療中

7、的另一前沿課題便是實現(xiàn)轉基因的可調控性?？烧{控轉基因系統(tǒng)是指在基因表達體系中設計加入特定的誘導劑反應元件，可在外源信號或者藥物的誘導下激活，開啟或關閉后續(xù)目的基因的轉錄、表達。在利用RNAi進行真核基因功能研究和治療目的時，多數(shù)轉基因都是持續(xù)表達的，沒有表達量和表達時間的調控，這種持續(xù)表達不論是在基因功能研究還是基因治療都存在很大的局限。如果對RNA沉默加以調控，設置開關，就可對選定靶基因的“開”、“關”(on/off)表達狀態(tài)進行比對

8、研究，從而準確獲得靶基因的功能分析。因此可調控、可誘導系統(tǒng)被認為是未來RNAi的重要發(fā)展方向。理想化的可調控基因表達系統(tǒng)是目標基因轉導后，在外源信號或者藥物的誘導下在適當時機開啟，按照施與誘導劑的劑量、時間依賴性進行精確的轉錄和翻譯，使其在治療過程中根據(jù)具體情況調節(jié)轉錄、表達劑量，并可在治療成功或出現(xiàn)毒副作用時隨時終止。 本課題組前期應用PAMAM—D納米載體介導靶向hTERTsiRNA成功轉染人舌鱗癌Tca8113細胞獲得良好

9、敲減效果，在此基礎上，本研究針對hTERT設計5條候選序列，篩選其中有效shRNA序列，制備慢病毒轉基因載體，轉導人口腔鱗癌細胞系：KB細胞，探索該系統(tǒng)的包裝流程、體外轉導效率、特異性敲減效能和相關抑瘤機制，并在此基礎上制備強力霉素(Doxycycline)誘導可調控慢病毒載體系統(tǒng)，初步研究其對誘導信號的時間、劑量依從性及其對hTERT基因的敲減效能。 本文分以下三部分： 第一部分靶向hTERTRNAi質粒載體的制備與有

10、效靶點篩選的研究； 第二部分靶向hTERT慢病毒載體RNAi系統(tǒng)制備及其治療口腔鱗癌的研究； 第三部分靶向hTERT可調控慢病毒載體RNAi系統(tǒng)制備及其治療口腔鱗癌的研究。 得出以下結論： 1.以5'—GCAAGTTGCAAAGCATTGGAA—3'序列設計的RNAi可有效、特異性地沉默hTERT基因的轉錄和表達水平。 2.構建外源基因的過表達載體質粒轉染工具細胞可作為RNAi敲減效率篩選的驗績標

11、靶。 3.成功制備靶向hTERTRNAi慢病毒載體，病毒滴度：5.0×107TU/ml。該慢病毒轉基因系統(tǒng)可有效轉染人口腔鱗癌KB細胞株；最佳轉導條件MOI為2.5。 4.轉導Day5thhTERTmRNA表達水平特異性下降：73.42％，hTERT蛋白表達下調：74.67％；Day10thhTERT蛋白表達下調：82.91％。 5.轉導Day5thCyclinD1mRNA表達水平下調：54.67％；Caspas

12、e—3上調：100.10％；Caspase—9表達上調：42.67％；細胞凋亡率水平上調206.33％。 6.成功制備調控蛋白KRAB過表達慢病毒載體，并可在293T細胞中有效表達KRAB蛋白。成功制備Tet—ON可調控靶向hTERTRNAi慢病毒載體，病毒滴度：2.5×108TU/ml。 7.KRAB過表達慢病毒載體與Tet—ON可調控靶向hTERTRNAi慢病毒載體按1:1比例(MOI=2.5)共轉導KB細胞，hTE

13、RT蛋白表達敲減效能與誘導劑強力霉素Dox呈現(xiàn)明顯劑量、作用時間依賴性：當未施加Dox誘導表達時，hTERT蛋白表達量僅有微量下調，可能為極低水平的“漏表達”所致；0.1μg/ml—4d、2.0μg/ml-12h可視為本調控系統(tǒng)的誘導劑初始閾值；在誘導劑達到2.0-4.0μg/ml—4d、2.0μg/ml—96h濃度—作用時間范圍時基本達到第二階段非調控慢病毒RNAi系統(tǒng)相應作用時間點的敲減水平(80％)，提示在此誘導劑濃度下，Tet—