慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)hTERT人口腔黏膜上皮穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、目的:口腔黏膜疾病是發(fā)生于口腔黏膜的所有疾病的總稱，其種類繁多，病因復(fù)雜且多數(shù)疾病的致病機(jī)理尚未完全明確。其中起源于口腔黏膜的惡性腫瘤不僅發(fā)病率高而且成為影響人們生活質(zhì)量的常見疾病，甚至嚴(yán)重威脅著生命健康。由于正常的OMECs體外培養(yǎng)困難，對(duì)細(xì)胞營養(yǎng)要求高而且存活時(shí)間短，一般傳代培養(yǎng)5～6代后即開始衰老死亡，這嚴(yán)重限制了我們對(duì)其發(fā)病機(jī)制的深入研究，因此，迫切需要一個(gè)能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代的OMECs系來作為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本文研究目的?.

2、使用慢病毒過表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建 pLVX-puro-hTERT重組質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行包裝；2.以包裝成功的慢病毒顆粒感染口腔黏膜上皮細(xì)胞（OMECs），建立穩(wěn)定表達(dá)外源性人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase。hTERT)基因的口腔黏膜上皮細(xì)胞系，為探索建立高效、穩(wěn)定的永生化口腔上皮細(xì)胞系提供新的思路。
　　方法：1.通過提取293T細(xì)胞總 RNA。RT-PCR方法擴(kuò)增獲得hTERT基

3、因全長(zhǎng)，構(gòu)建重組慢病毒載體pLVX-puro-hTERT并使用輔助包裝系統(tǒng)將其包裝為慢病毒顆粒；2.通過使用DisepaeⅡ酶分離，結(jié)合Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，體外分離培養(yǎng)獲取原代OMECs，并用包裝好的慢病毒顆粒感染OMECs，通過嘌呤霉素抗性篩選得到陽性克隆，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察其生物學(xué)性狀；3.采用qRT-PCR和Western

4、 blot檢測(cè)培養(yǎng)7代后感染細(xì)胞中hTERT基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.通過RT-PCR獲得目的基因片段hTERT，核酸電泳檢測(cè)可見3kb處有一條亮帶，與目的基因大小基本一致。2.重組質(zhì)粒pLVX-puro-hTERT經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切鑒定后，可在3.3kb左右處得到一條亮帶，初步表明hTERT已成功插入慢病毒載體 pLVX-puro。3.通過對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行 DNA測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)重組慢病毒載體 pLV

5、X-puro-hTERT構(gòu)建成功。4.顯微鏡下觀察可見成功轉(zhuǎn)染hTERT的OMECs與正常OMECs形態(tài)相似，細(xì)胞呈多邊形，“鋪路石”狀緊密排列，具有典型的上皮細(xì)胞特征。而轉(zhuǎn)染空載體后的細(xì)胞形態(tài)較不規(guī)則，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體后的細(xì)胞傳4-5代后生長(zhǎng)緩慢，逐漸衰老死亡，而轉(zhuǎn)染 hTERT后的OMECs仍生長(zhǎng)迅速并且增殖穩(wěn)定。5. qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后OMECs中hTERT的相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示：hTERTmRNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高表達(dá)，與

6、正常OMECs組中hTERTmRNA的表達(dá)量呈顯著性差異。表明慢病毒介導(dǎo)的hTERT基因片段已穩(wěn)定整合到OMECs的基因組中并高表達(dá)（P＜0.01）。6. Western blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中hTERT蛋白成功表達(dá)，與正常細(xì)胞組呈顯著差異。這說明hTERT基因已成功整合入口腔黏膜上皮細(xì)胞的基因組并可進(jìn)行翻譯。
　　結(jié)論：本研究通過慢病毒法成功建立了過表達(dá)hTERT的OMECs穩(wěn)定細(xì)胞系，初步證明了使用慢病毒載體介導(dǎo)hTE